绿僵菌抗药性菌株的驯化选育本科论文.docx

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绿僵菌抗药性菌株的驯化选育本科论文

毕业论文（设计）

题目：

绿僵菌抗药性菌株的驯化选育

毕业论文任务书

论文（设计）

题目

绿僵菌抗药性菌株的驯化选育

下发任务日期

学生姓名

指导教师

一.论文（设计）主要内容

（1）制作培养基，菌落扩繁

（2）绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导

（3）绿僵菌菌株抗药性水平的确定

（4）绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较

（5）绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株丝生长速率的比较

（6）绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性

二.论文（设计）的基本要求

（1）掌握文献资料检索技术。

（2）掌握试验方案设计方法并进行可行性论证。

（3）学习真菌的纯化接种的方法。

（4）掌握掌握产孢量和生长速率的测定方法。

（5）掌握绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性测定方法。

（6）学会对数据采集、整理和分析的技能。

（7）独立撰写出符合要求的论文。

三.论文（设计）工作进度安排

阶段

论文（设计）各阶段名称

日期

1

查阅资料

2010.10~2010.11

2

分离真菌，纯化，扩繁

2010.11~2010.1

3

菌株的鉴定，抗药性水平的确定

2011.1~2011.2

4

绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量和生长速率的比较

2011.2~2011.3

5

绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性

2011.3~2011.4

6

整理数据撰写论文

2011.4~2011.6

备注：

四.应收集的资料及主要参考文献（指导教师指定）

1.《植病研究法》，方中达编著，北京：

中国农业出版社，1998

2.《植物化学保护研究方法》，慕立义编著，中国农业出版社，1991

3．有关绿僵菌和嘧霉胺的相关文献资料.

4．有关绿僵菌研究进展和方面的文献资料

说明：

此任务由指导教师填写一式两份，一份发给学生，一份发给指导教师留存。

沈阳农业大学毕业论文（设计）选题审批表

选题名称

绿僵菌抗药性菌株的驯化选育

题目来源

导师指定

学号

姓名

专业

植物保护

指导教师

职称

副教授

研究

内容

（1）制作培养基，菌落扩繁

（2）抗药性菌株的诱导

（3）抗药性水平的确定

（4）抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较

（5）抗性菌株与敏感菌株丝生长速率的比较

（6）抗性菌株的遗传稳定性确定

研究

计划

培养基制作，菌落扩繁　2010年11月1日～2010年11月20日

抗药性菌株的诱导2010年11月20日～2011年1月20日

抗药性水平的确定2011年1月20日～2011年2月10日

抗性菌株与敏感菌株2011年2月11日~~2011年3月11日

孢量和菌丝生长的比较

抗性菌株的遗传稳定性确定2011年3月12日～2010年4月11日

撰写论文　　　　　　2010年4月12日～2010年6月5日

特色

试验通过室内化学药剂诱导，初步获得了对嘧霉胺的抗性菌株，研究了抗药性菌株的生物学性状，评估其抗药性，为嘧霉胺的合理推广应用提供依据。

指导教师意见

教研室意见

学院意见

毕业论文指导记录

学生姓名

专业

植物保护

指导教师姓名

职称

副教授

本年度指导毕业生人数

11人

论文（设计）题目

绿僵菌抗药性菌株的驯化选育

指导过程

时间

地点

指导内容

2010．11．6

2010．11．20

2010．11．25

2010．11．26

2010．12．10

2011．1．.20

2011．2．2

2011．2．5

2011．2．8

2011．3．20

2011．4．18

农业大学248实验室

农业大学246实验室

农业大学246实验室

农业大学246实验室

农业大学248实验室

农业大学248实验室

农业大学246实验室

农业大学250实验室

农业大学248实验室

农药学教研室

农药学教研室

查阅相关绿僵菌文献

如何制作PDA培养基

如何使用无菌操作台

识别菌落形态

接种，扩繁分离出来的菌株

鉴定分离出来的菌株

测量生长速率

测量产孢量

绿僵菌菌株抗药性水平的确定

绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性

总结试验，数据整理

学生签字：

年月日

指导教师签字：

年月日

教研室主任签字：

年月日

沈阳农业大学毕业论文考核表

论文题目：

绿僵菌抗药性菌株的驯化选育

姓名：

学号：

专业：

植物保护

指导教师评语：

指导教师（签字）：

年月日

评阅人评审意见：

评阅人（签字）：

年月日

成绩：

答辩委员会意见：

主任委员（签字）：

年月日

注：

答辩委员会意见除填写简要评语、给出成绩外，还要提出是否授予学位的建议

目录

摘要1

Abstract2

前言3

1材料与方法5

1.1材料5

1.1.1　供试病原菌5

1.1.2　供试药剂5

1.1.3供试培养基5

1.1.4仪器及用品5

1.2试验方法5

1.2.1绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导5

1.2.2绿僵菌菌株抗药性水平的确定5

1.2.3绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较6

1.2.4绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株丝生长速率的比较6

1.2.5绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性6

2结果与分析6

2.1绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导6

2.2绿僵菌菌株抗药性水平的确定7

2.3绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较7

2.4绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株的菌丝生长速率的比较8

2.5绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性9

3结论与讨论10

3.1结论10

3.2讨论10

参考文献13

致谢15

摘要

绿僵菌（Metarhiziumanisopliae）半知菌类、丛梗菌目、丛梗霉科、绿僵菌属，具有广谱性。

绿僵菌对寄主的入侵是寄主与病原菌之间的生理生化作用的综合结果，可通过体壁、气门、消化道等多种途径侵染宿主，其中体壁途径是主要方式。

本文研究嘧霉胺驯化诱导绿僵菌产生抗性菌株，研究绿僵菌对嘧霉胺的抗性风险。

绿僵菌在含嘧霉胺的培养基上经逐代驯化，获得了抗嘧霉胺的菌株R1、R2、R3、R4，经抗药性水平测定，R1、R2、R3、R4的抗性倍数分别为10ug/ml，100ug/ml，500ug/ml，1000ug/ml四株抗药性菌株均为对嘧霉胺的抗性菌株。

本文比较了抗药性菌株和敏感性菌株的生物学性状。

采用菌丝生长速率法测定了抗性菌株与敏感菌株的菌丝生长速率，结果表明经7d培养抗性菌株菌落直径在0.5-1.1cm之间，而敏感菌株为1.3cm，生长速率存在明显差异；在及抗性菌株与敏感菌株的产孢量大约都在3.6×107个/ml，说明室内诱导的高抗突变体不能正常生长，菌株对药剂的抗药性水平与菌株产孢能力没有相关性，而是由菌株本身决定的。

本试验初步研究了抗性菌株的遗传稳定性，抗性菌株的第零代到第六代的的结果表明绿僵菌的抗药性菌株与敏感菌株的不同转代的有差异性，从第零代第三代到第九代逐渐减小，第零代与第三代和第六代下降明显，第三代与第六代下降幅度很小，但始终保持着对嘧霉胺的高等抗性，表明抗性菌株具有良好的遗传稳定性。

关键词：

绿僵菌；嘧霉胺；抗性菌株；生物学特性；遗传稳定性

Abstract

Metarhiziumanisopliaeofimperfectfungi，bacteriapresentstembundle，bundlepullulansBranch，Metarhiziumgenus，withabroadspectrum.Metarhiziumanisopliaeonthehostandpathogeninvasionofhostphysiologicalandbiochemicalrolesbetweenthecombinedresultof，throughthebodywall，valves，andotherwaystoinfectthehostalimentarytract，whichwayisthemainwaythebodywall.DomesticationofthisstudypyrimethanilresistanceinducedbyMetarhiziumanisopliaestrainsofMetarhiziumpyrimethanilresistancerisk.

MetarhiziumPyrimethanilcontainingmediumdomesticatedbyeachgeneration，accesstothestrainsofantiPyrimethanilR1，R2，R3，R4，measuredbytheresistancelevel，R1，R2，R3，R4oftheresistanceratioRespectively，10ug/ml，100ug/ml，500ug/ml，1000ug/mlfourresistantstrainswereresistanttothestrainsofpyrimethanil.

Thispapercomparesthesensitivityofdrug-resistantstrainsandstrainsofbiologicaltraits.Mycelialgrowthratemethodwiththeresistantstrainsandsensitivestrainsofmyceliumgrowthrate，theresultsshowthattheresistantstrainsbythe7dculturecolonybetween0.5-1.1cmindiameter，andsensitivestrainsof0.9cm，growthRatesignificantlydifferent;inandresistantstrainsandsensitivestrainsinsporulationofabout3.6×107个/ml，showshighresistancetoindoorinducedmutantscannotgrownormally，thelevelofstrainsandstrainsresistantpharmaceuticalsporulationAbilityofnocorrelation，butthedecisionbythestrainitself.

Preliminarystudyofthetestthegeneticstabilityofresistantstrains，resistantstrainsofthezerogenerationtothesixthgenerationoftheresultsshowedthattheresistantstrainsofMetarhiziumanisopliaeandsensitivestrainshavedifferenttransferonbehalfofthedifferences，fromzeroTotheninthgenerationofthethirdgenerationdecreases，thezeroandthird-generationandsixthgenerationdecreasedsignificantly，thethirddecreaseingenerationandsixthgenerationofsmall，butalwaysmaintainedthehighresistancetopyrimethanil，indicatingthattheanti-Strainswithagoodgeneticstability.

Keywords:

Metarhiziumanisopliae;pyrimethanil;resistantstrain;biologicalcharacteristics;genetic

stability

前言

绿僵菌是世界上最早大量生产并用于田间防治的昆虫病原真菌之一。

能够寄生于多种害虫的一类真菌，通过体表或取食作用进入害虫体内，在害虫体内不断增繁殖通过消耗营养、机械穿透、产生毒素，并不断在害虫种群中传播，使害虫致死。

绿僵菌具有一定的专一性，对人畜无害，同时还具有不污染环境、无残留、害虫不会产生抗药性等优点。

是自然界中一类有效而且极其重要的自然控制因子，不需要人类的干预就能造成许多害虫周期性的大量死亡。

流行病发生以后，可以控制害虫的种群数量，减少化学农药的用量，维护生态平衡，降低防治成本，减少环境污染，有利于可持续发展。

就病原来说，昆虫对真菌易被感染，因为真菌是通过孢子产生芽管而直接穿透体壁进行感染的，而其它微生物如病毒、细菌和原生动物主要是经口传染。

绿僵菌对寄主的入侵是寄主与病原菌之间的生理生化作用的综合结果，可通过体壁、气门、消化道等多种途径侵染宿主，其中体壁途径是主要方式。

绿僵菌制剂属于活体类微生物，其防效在很大程度上受到外界环境条件的制约，尤其是温度、湿度和紫外线的影响，为了解决这一难题，必须依赖剂型的开发和改进，添加促进孢子在低温、低湿条件下萌发的助剂和紫外保护剂。

中国研究开发绿僵菌起步晚，经过多年的研究开发在菌株选育、生产工艺、剂型和防治对象上已有长足进步。

目前，重庆大学基因研究中心完成了杀蝗绿僵菌生物农药的研制，取得了重要的研究成果，生产的产品已在国内多个省份示范试验。

与传统的化学药物不同，绿僵菌复合剂用虫生真菌消灭白蚁、蝗虫等害虫。

田间大规模应用试验的结果显示，绿僵菌能适用于室内外，在防治桉树白蚁方面具有用量少、成本低，保证苗木成活率95％以上的特点。

据悉，目前绿僵菌灭白蚁、蝗虫的方法已经作为国家重点推广应用项目，可广泛应用于农田、林木、桥梁等多个领域的防治工作。

每株桉树增加2分钱的成本，就能使95％以上的桉树逃脱白蚁的摧残。

利用绿僵菌防治害虫的方法很多，如它可支撑粉剂或液剂进行大面积田间撒布，也可拌种或混入肥料内，或制成颗粒剂施用防治害虫。

在绿僵菌剂中加入少量化学农药，有增效作用。

可以防治松毛虫，玉米螟，稻叶蝉和稻飞虱，大豆食心虫等。

嘧霉胺（pyrimethanil）是近几年出现的新一代嘧啶胺类杀菌剂，20世纪90年代初，嘧霉胺率先在欧洲大面积推广，1998年嘧霉胺在我国首次获得农药登记。

具有保护、叶片穿透及根部内吸活性，对葡萄、草莓、番茄、洋葱、豌豆、黄瓜、茄子、果树的病害有优划的预防、治疗特别是铲除效果。

嘧霉胺作用位点单一，属高抗药性风险杀菌剂，它的作用机理独特，即抑制病原菌蛋白质分泌，降低某些水解酶水平，而这些水解酶与病原菌引起寄生组织坏死有关。

嘧霉胺同现在应用的三唑类、二硫代甲酸酯类，苯并味唑类及乙霉威类杀菌剂，无交互抗性，因而对抗性病原菌或敏感病菌均有效。

嘧霉胺使用较多的沈阳市、辽阳市、大连市和鞍山市抗药性频率较高。

在离体条件下，抗药性菌株具有良好的遗传稳定性及与敏感菌株相似的适应性，这意味着抗药性菌株在田间具有较高的适合度，如果嘧霉胺长期、连续使用将导致抗药性菌株比例上升，防治失败。

嘧啶胺类杀菌剂嘧菌环胺目前尚未在辽宁省大面积推广使用，从其与同类杀菌剂嘧霉胺之间存在正交互抗性结果看出。

因此，为延缓其抗性产生，建议与不同作用机制的杀菌剂轮换使用，制定合理的用药次数与频率。

年已有多篇关于对嘧霉胺产生抗药性的报道。

甚至出现了高抗药性菌株。

嘧霉胺在辽宁省目近前仍是防治中的有效药剂。

但许多农民习惯于连年使用同种杀菌剂，且一季喷洒多次，这给病原菌产生抗药性创造了极为有利的条件，为延长嘧霉胺的使用寿命，避免因产生严重抗性给生产造成重大损失，建议根据不同地区的抗药性水平积极采取相应措施，如推广综合防治技术、减少每季用药次数、与不同作用机制的杀菌剂复配或交替使用等。

目前，嘧霉胺在辽宁省及全国范围对作物的防治中使用范围比较广。

许多农民习惯于连年使用同种杀菌剂，且一季喷洒多次，这给病原菌产生抗药性创造了极为有利的条件，为延长嘧霉胺的使用寿命，避免因产生严重抗性给生产造成重大损失，建议根据不同地区的抗药性水平积极采取相应措施，如推广综合防治技术、减少每季用药次数、与不同作用机制的杀菌剂复配或交替使用等。

在生产中注意IPM即对病害的综合防治，采用生态防治等多种方法减轻病害压力。

在嘧霉胺的使用过程中，要合理用药避免任意减小嘧霉胺的使用倍数，增大药剂的选择压力；同时避免长期使用嘧霉胺，减少同一生长季的用药次数。

将不同作用机制的杀菌剂复配或交替使用，在复配或交替使用时可以使用与嘧霉胺无交互抗性的药剂：

多菌灵或者腐霉利，避免使用有正交互抗性的嘧菌环胺。

同时加强田间抗药性的检测，一旦发现问题，及时采取相应措施。

本试验通过室内化学药剂诱导，初步获得了对嘧霉胺的抗性菌株，研究了抗药性菌株的生物学性状，评估其抗药性，以期为嘧霉胺的合理推广应用提供依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1　供试病原菌

绿僵菌（Metarhiziumanisopliae（Metschn.）Sor.），由沈阳农业大学农药实验室提供。

1.1.2　供试药剂

20%嘧霉胺悬浮剂，吸取1ml20%嘧霉胺悬浮剂，用无菌水稀释至10ml，配制成20000µg·mL-1母液，供本试验使用。

1.1.3供试培养基

PDA培养基：

马铃薯（煮汁）200g，葡萄糖20g，琼脂20g，1000毫升水。

将马铃薯洗净去皮切块，加水煮沸半小时，用双层纱布过滤薯块，补足水量，加入琼脂，加热溶化，再加糖，待完全化后，乘热用双层纱布过滤到1000ml的塑料烧杯中，乘热分装到三角瓶中，每瓶装量不超过三角瓶容量的2/3，塞好棉塞，121℃高压湿热灭菌25min。

培养基经灭菌后，必须放在37C温箱培养24h，无菌生长者方可使用。

PDA培养基一般不需要调pH。

对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。

如果培养基偏酸或偏碱时，可用lmol／LNaOH或lmol／LHCL溶液进行调节。

调节时应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。

培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基，用于菌类的震荡培养。

培养基也可以加入氯霉素或土霉素，加入量为0.1g/L培养基，主要是为了抑制细菌的生长，减少干扰性。

1.1.4仪器及用品

移液枪、培养皿、胶头滴管、试管架、玻璃棒、孢子测微器、酒精灯、试管、移植针、漏斗、凹玻片、纱布、滤纸、250ml三角瓶、显微镜、计数器、恒温箱、高压灭菌锅、恒温培养箱

1.2试验方法

1.2.1绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导

将绿僵菌菌株接种到含亚致死剂量的嘧霉胺PDA平板上，25℃培养5d，于菌落边缘挑取菌丝接种到另一含嘧霉胺的平板上，逐渐提高嘧霉胺浓度，直至绿僵菌在含1000ug/ml的嘧霉胺平板上能正常生长，即获得抗嘧霉胺的抗药性菌株。

1.2.2绿僵菌菌株抗药性水平的确定

采用菌落生长直径法。

将绿僵菌敏感菌株S及获得的抗药性菌株R1、R2、R3和R4分别在PDA培养基上25℃预培养5d，用直径5mm的打孔器在靠近菌落边缘打取菌饼。

将嘧霉胺与溶化的PDA培养基混匀，配成10ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，1000ug/ml系列浓度的药液培养基混合物，于PDA培养基平板中央接种。

25℃培养7绿僵菌5d，采用十字交叉法测量菌落直径。

每处理重复3次，以不加药剂的PDA培养基为对照，计算嘧霉胺抑制各褐斑病菌菌丝生长的EC50及相关系数R。

根据联合国粮农组织（FAO）抗性倍数大于10的为高等抗性，抗性倍数在5-10为中等抗性。

1.2.3绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株产孢量的比较

用直径5mm的打孔器在靠近菌落边缘打取菌饼，分别取敏感菌株S及抗药性菌株R1、R2、R4、R5的30个菌饼置于无药PDA平板上中间位置培养，每一菌株三次重复，黑暗下25℃培养15d，再用直径5mm的打孔器在靠近菌落边缘打取菌饼，取5个菌饼后再加入5mL无菌水，冲洗孢子，过滤得到孢子悬浮液，用血球计数板记数孢子数。

每个菌株重复3次，比较不同菌株产孢量的区别。

1.2.4绿僵菌的抗性菌株与敏感菌株丝生长速率的比较

用直径5mm的打孔器在靠近菌落边缘打取菌饼，分别取诱导后的抗性菌株R1、R2、R3、R4和敏感菌株S的一个菌饼置于无药PDA平板上中心位置培养，25℃培养7d，每个菌株四次重复。

测量不同菌丝直径，对比抗性菌株与敏感菌株的生长速率。

1.2.5绿僵菌抗性菌株的遗传稳定性

用直径5mm的打孔器在靠近菌落边缘打取菌饼，分别将抗性菌株R1、R2、R3、R4接种于不同药剂浓度（10ug/ml，50ug/ml，100ug/ml，1000ug/ml）的PDA平板上，25℃培养5d后转接，连续继代培养6代。

测定第0、第3和第6代的菌丝直径。

每处理三次重复，并对抗性菌株的EC50值和R值进行比较。

2结果与分析

2.1绿僵菌对嘧霉胺抗药性菌株的诱导

用直径5mm的打孔器从培养好的绿僵菌的菌落边缘打孔，然后将菌碟接种到含嘧霉胺亚致死剂量的L-asp平板上，25℃黑暗培养，然后逐步提高含药平板的药剂浓度，自下一代菌落边缘挑取菌碟接种到含毒平板上培养。

在浓度为10ug/ml时选取不同菌株编号（R1---R16），本试验选取R1、R2、R3、R4四个菌株与S菌株为研究对象。

图1是绿僵菌株和抗药性菌株在嘧霉胺浓度为1000ug/ml时的生长状况的比较，从图中可以看出，敏感菌株S生长明显受到抑制，抗性菌株R1、R2、R3、R4生长状况良好，即获得绿僵菌对嘧霉胺的抗药性菌株。

图1是绿僵菌株和抗药性菌株在嘧霉胺浓度为1000ug/ml时的生长状况的比较

2.2绿僵菌菌株抗药性水平的确定

菌株的抗性指数是衡量某一菌株对一种药剂的抗性能力的大小，是研究菌株对特定农药有效性的一种反映。

抗性指数越大的则表明药剂对这种菌株的毒杀作用越小，相反，抗性指数越小则表明药剂对这种菌株的毒杀作用越大。

这也是评价农药是否还有经济价值的一种依据。

从表1：

可以清楚的看出这四株绿僵菌对嘧霉胺的抗性菌株已经有高等程度的抗性。

采用菌落生长直径法测定了敏感性菌株和抗药性菌株对嘧霉胺的敏感性，敏感性菌株的EC50仅为0.02586。

R1、R2、R4、R5的EC50值近而计算出其抗性指数，说明经嘧霉胺诱导的4株抗性菌株对嘧霉胺的使用已经存在很大的风险。

表1.绿僵菌敏感菌株与抗嘧霉胺菌株的比较

菌株

回归方程

Y=a+bX

EC50

（µg·mL-1）

R

抗药性水平

S

Y=0.7965+6.2165

0.02970

0.9671