蛋白酶活力测定法.docx
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蛋白酶活力测定法
蛋白酶活力测定法
中华人民共和国专业标准
蛋白酶活力测定法SB/T10317-1999
Measurementofproteinaseactivity
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本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1福林法
1.1试剂及溶液:
以下试剂都为分析纯
1.1.1福林试剂（Folin试剂）:
于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）
100g,钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
取去冷凝器,加入硫酸锂（Li2SO4）50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,
以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。
若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再
煮沸除去之。
冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗（No4～5）过滤,置于棕色瓶中保存。
此溶
液使用时加2倍蒸馏水稀释。
即成已稀释的福林试剂。
1.1.20.4mol碳酸钠溶液:
称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g,定容至1000mL。
1.1.30.4mol三氯乙酸（TCA）溶液:
称取三氯乙酸（CCL3COOH）65.4g,定容至1000mL。
1.1.4pH7.2磷酸盐缓冲液:
称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）31.2g,定容至1000mL,即
成0.2mol溶液（A液）。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）71.63g,定容至1000mL,即成
0.2mol溶液（B液）。
取A液28mL和B液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1molpH7.2的磷酸盐缓冲液。
1.1.52%酪蛋白溶液:
准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在
水浴中加热使溶解（必要时用小火加热煮沸）,然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即
成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
1.1.6100μg/mL酪氨酸溶液:
精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g,逐
步加入6mL1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10
mL,以0.2N盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。
此溶液配成后也应及时使
用或放入冰箱内保存,以免繁殖细菌而变质。
1.2仪器
a.分析天平:
感量0.1mg;
b.581-G型光电比色计或72型分光光度计;
c.水浴锅;
d.1、2、5、10mL移液管等。
1.3操作
1.3.1标准曲线的绘制
1.3.1.1按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液（表1）。
表1配制各种不同浓度的酪氨酸溶液
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┃管号
试剂┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━
┃1┃2┃3┃4┃5┃6
━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
蒸馏水,mL┃10┃8┃6┃4┃2┃0
100μg/mL酪氨酸,mL┃0┃2┃4┃6┃8┃10
酪氨酸最终浓度,μg/ml┃0┃20┃40┃60┃80┃100
━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━
1.3.1.2测定步骤:
取6支试管编号按表1分别吸取不同浓度酪氨酸1mL,各加入0.4mol
碳酸钠5mL,再各加入已稀释的福林试剂1mL。
摇匀置于水浴锅中。
40℃保温发色20min在
581-G型光电比色计上分别测定光密度（OD）（滤色片用65**#）或用72型分光光度计进行
测定（波长660nm）。
一般测三次,取平均值。
将1～6号管所测得的光密度（OD）减去1号管（
蒸馏水空白试验）所测得的光密度为净OD数。
为了清楚起见。
再列出表格如下（表2）。
表2
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┃管号
试剂┣━━┳━━┳━━┳━━┳━━┳━━━
┃1┃2┃3┃4┃5┃6
━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
按表1制备的不同浓度酪氨酸,mL┃1┃1┃1┃1┃1┃1
━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
0.4mol/LNa2CO3,mL┃5┃5┃5┃5┃5┃5
━━━━━━━━━━━━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
福林试剂,mL┃1┃1┃1┃1┃1┃1
━━━━━━━━━━┳━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
┃1┃┃┃┃┃┃
┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
┃2┃┃┃┃┃┃
OD值┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
┃3┃┃┃┃┃┃
┣━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
┃平均┃┃┃┃┃┃
━━━━━━━━━━┻━━━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━╋━━━
净OD值┃0┃┃┃┃┃
━━━━━━━━━━━━━━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━┻━━━
以净OD值为横坐标,酪氨酸的浓度为纵坐标,绘制成标准曲线（或可求出每度OD所相
当的酪氨酸量K）。
1.3.2样品稀释液的制备。
1.3.2.1测定酶制剂:
称取酶粉0.100g,加入pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL,吸取此
液5mL,再用缓冲液稀释至25mL,即成5000倍的酶粉稀释液。
1.3.2.2测定成曲酶:
称取充分研细的成曲5g,加水至100mL,在40℃水浴内间断搅拌
1h,过滤,滤液用0.1molpH7.2磷酸盐缓冲液稀释到一定倍数（估计酶活力而定）。
1.3.3样品测定:
取15×100mm试管3支,编号1、2、3（做2只也可）,每管内加入样品
稀释液1mL,置于40℃水浴中预热2min,再各加入经同样预热的酪蛋白1mL,精确保温
10min,
时间到后,立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL,以终止反应,继续置于水浴中保温20min,使
残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取15×150mm试管3支,编号1、2、3,每管内加入滤
液1mL,再加0.4mol碳酸钠5mL,已稀释的福林试剂1mL,摇匀,40℃保温发色20min后进行光
密度（OD）测定。
空白试验也取试管3支,编号
（1）、
（2）、（3）,测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加
0.4mol三氯乙酸2mL,使酶失活,再加入酪蛋白。
为了清楚起见,分别列出表格于下（见表3及表4）。
表3
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┃管号┃试剂┃管号
试剂┣━┳━┳━┫┣━━┳━━┳━━
┃1┃2┃3┃┃
（1）┃
（2）┃（3）
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预热酶液,mL┃1┃1┃1┃预热酶液,mL┃1┃1┃1
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预热2%酪蛋白,mL┃1┃1┃1┃0.4mol三氯乙酸,mL┃2┃2┃2
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作用10min（精确计时）┃作用10min（精确计时）┃┃
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0.4mol三氯乙酸,mL┃2┃2┃2┃预热2%酪蛋白,mL┃1┃1┃1
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表4
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┃管号
试剂┣━┳━┳━━┳━━┳━━┳━━━
┃1┃2┃3┃
（1）┃
（2）┃（3）
━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━
滤液,mL┃1┃1┃1┃1┃1┃1
━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━
0.4molNa2CO3,mL┃5┃5┃5┃5┃5┃5
━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━
福林试剂,mL┃1┃1┃1┃1┃1┃1
━━━━━━━━━━╋━╋━╋━━╋━━╋━━╋━━━
OD值┃┃┃┃┃┃
━━━━━━━━━━╋━┻━┻━━╋━━┻━━┻━━━
平均OD值┃┃
━━━━━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
净OD值┃┃0
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样品的平均光密度（OD）一空白的平均光密度（OD）=净OD值。
1.4计算
在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。
A1
样品蛋白酶活力单位（干基）=━━×4×N×━━━………………………
（1）
101-W
式中:
A——由样品测得OD值,查标准曲线得相当的酪氨酸微克数（或OD值×K）;
4——4毫升反应液取出1mL测定（即4倍）;
N——酶液稀释的倍数;
10——反应10min;
W——样品水分百分含量。
1.5注意事项
以上介绍的方法用于测定中性蛋白酶（pH7.2）。
若要测定酸性蛋白酶或碱性蛋白酶,
则把配制酪蛋白溶液和稀释酶液用的pH缓冲液换成相应pH缓冲液即可。
现把几种常用pH
缓冲液配方提供如下:
1.5.1pH7.5磷酸盐缓冲液（0.02mol/L）
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）0.5g以蒸
馏水溶解定容至1000mL。
1.5.2pH2.5乳酸-乳酸钠缓冲液（0.05mol）
A液:
称取80%～90%乳酸10.6g,加蒸馏水稀释定容至1000mL。
B液:
称取70%乳酸钠16g,加水稀释定容至1000mL。
取A液16mL与B液1mL混合稀释一倍即成。
1.5.3pH3.0乳酸-乳酸钠缓冲液（0.05mol）
A液:
称取80%～90%乳酸10.6g,以水定容至1000mL。
B液:
称取70%乳酸钠16g,蒸馏水溶解定容至1000mL。
取A液8mL与B液1mL,混合稀释一倍即成。
1.5.4pH10硼砂-氢氧化钠缓冲液
A液:
称取硼砂19.08g,用蒸馏水溶解定容至1000mL（0.05mol）。
B液:
称取氢氧化钠8g,用蒸馏水溶解定容至1000mL（0.2N）。
取A液250mL,B液215mL混合,用蒸馏水稀释定容至1000mL即成。
1.5.5pH11.0硼砂-氢氧化钠缓冲液
A液:
称取硼砂19.08g,用蒸馏水定容至1000mL。
B液:
称取氢氧化钠4g,用蒸馏水定容至1000mL。
取A液与B液等量混合。
1.5.62%酪蛋白溶液配成酸性时,须先加数滴浓乳酸,使之湿润以加速其溶解。
2甲醛法
成曲蛋白酶活力的测定,如用福林法测定确有困难时,可用甲醛法测定作过渡。
2.1仪器
a.分析天平:
感量0.01g;
b.水浴锅;
c.电烘箱;
d.容量瓶、吸管、滴定管等。
2.2试剂与溶液
a.1%酚酞指示剂;
b.0.1%麝香草酚蓝;
c.0.1N氢氧化钠液、甲醛（试剂配制法同氨基态氮的测定,见ZBX66038—87《氨
基态氮测定法》）。
2.3操作
2.3.1目测法
称取研细均匀的成曲样品10g,放入250mL锥形瓶中,加55℃温水80mL,充分摇匀,置于
55℃水浴锅中保温3h,取出后加热煮沸以破坏酶活力,冷却后定容至100mL,充分摇匀后以
脱脂棉过滤,吸取滤液10mL,移至150mL锥形瓶中,加水50mL,1%酚酞指示剂0.2mL,以0.1N
氢氧化钠标准溶液滴定至刚显微红色（pH8.2）,记下滴定数作为总酸,继续加甲醛10mL,用
0.1N氢氧化钠液滴定至深红色（pH8.5）为终点,若再加麝香草酚蓝1mL作指示剂,则滴至紫
红色为终点。
记下滴定数,减去空白数后计算成氨基态氮。
另称取曲10g做水分,再折算成
干基数。
2.3.2酸度计法
所用仪器、药品、操作方法等与氨基态氮测定法同（见ZBX66038-87）。
2.4计算
蛋白酶活力（克氨基态氮/100g）（干基）
（V-***Vo）×N×0.014100
=━━━━━━━━━━×━━━………………………………
（2）
101-W
10×━━━
100
式中:
V——加入甲醛后氢氧化钠标准液滴定数,mL;
***Vo——甲醛空白滴定数,mL;
W——曲水分,%;
N——氢氧化钠标准溶液的当量数,N;
0.014——氮的毫克当量数。
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附加说明:
本标准由商业部副食品局提出。
本标准由上海市酿造科学研究所起草。
本标准主要起草人须凤高。
━━━━━━━━━
*本法实质上是在一定温度下、一定时间内,成曲利用自身的蛋白酶把自身原料中的蛋
白质水解成氨基酸。
以测定氨基态氮的量来衡量蛋白酶活力的数值。
在培养和堆放过程,
环境温度和自身含有水分,故已有少量氨基酸生成。
为了能和福林法的酶活力进行对照,
可用空白试验以扣除此误差,方法是另取一曲样于开始时即将成曲酶活杀灭,其余操作步
骤完全相同。
杀酶的方法是把已煮沸的蒸馏水70mL倾入10g成曲中,并马上继续把成曲液
煮沸几分钟,其余操作与样品同,成曲和甲醛的空白一起算成Vo。
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中华人民共和国商业部1987-11-20批准1988-07-01实施
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