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引言
在切达奶酪的9±
12个月成熟期，复杂的生化和微生物过程形成了独特的香味和滋味。
这些是由发酵剂和可能的非发酵剂乳酸菌进行调节的，以及其各自的种群内部的的急剧变化促进的（Crow等人1995;
Fox等人1998）。
传统的发酵剂群是由乳酸乳球菌属选择控制的，表现出具有良好种群发展（Martley和相关的某些特性Lawrence1972）。
为期3个月的生产过程中，发酵剂，无法在成熟的奶酪的选择性条件下（低水分，pH值和温度，再加上高盐环境），衰退和自溶（Wilkinson等人.1994），同时非发酵剂乳酸菌的急剧增加，从3log到6log和7cfu
之间（NaylorandSharpe1958；
JohnsandCole1959年）。
商业切达奶酪中非发酵剂种群在很大程度上仍然不受控制，因为非发酵剂乳酸菌作为影响生产的主要因素仍然不受控制，因为在生产中非发酵剂乳酸菌不是特意添加的。
奶酪中这一次要菌群的来源可能是由于巴氏杀菌后空气传播的污染导致的（NaylorandSharpe，1958年），制作奶酪的设备或材料（ReiterandSharpe1971）或巴氏杀菌的存在（MartleyandCrow1993;
JordanandCogan1999）。
噬温的（第二组）乳酸菌在非发酵剂乳酸菌群中占优势（JordanandCogan1993;
Fitzsimonsetal.1999），尽管微球菌和片球菌也可以被发现（Dacre1958;
FryerandSharpe1966;
BhowmilkandMarth1990）。
然而切达奶酪的芳香味离不开非发酵剂乳酸菌（1982的法案中）的参与，人们普遍认为非发酵剂乳酸菌有助于奶酪成熟（Broomeetal.1990;
Trepanieretal.1991,1992;
Lynchetal.1999）。
这也可能至少可以表明一些在不同的工厂生产的奶酪的味道的变化，并且在一个特定的工厂随着时间的推移，是由奶酪中的非发酵剂乳酸菌群的差异导致的.然而，非发酵剂乳酸菌与一些切达干酪质量缺陷是有关联的，包括奶酪的异味和奶酪的结构疏松（（MartleyandCrow1993））。
相关大量的非发酵剂乳酸菌群的知识和奶酪中的菌株多样性，对于评估其对奶酪香味产生的贡献是至关重要的。
对存放8周的市售爱尔兰契达干酪的研究表明,其微生物群落是由55%的副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）、28%的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）和14%弯曲乳杆菌（Lactobacilluscurvatns）组成（（JordanandCogan1993）,然而成熟的奶酪中（9-24个月）包含96.4%副干酪乳杆菌的，2.1%植物乳酸杆菌，0.3%的乳酸杆菌，0.3%的短杆菌，0.9%的菌株不能辨别（Fitzsi-monsetal.1999）。
在后来的研究中,聚合酶基础能上够处理大量的隔离种群随机扩增多态性DNA（RAPD）方法，是用来确认成熟的切达干酪中优势菌种和菌群。
在当前的研究中,RAPD被用来调查研究多样性非发酵剂乳酸菌的空间分布和奶酪块内部和之间的物种动力学，以及借助其自身的优势辨别菌株在成熟过程中的种下等级水平，对风味的产生发挥着巨大的影响。
材料和方法
奶酪样品
同一天制作的两块（标记S和T）为期两个月的切达奶酪，和三块新鲜的切达奶酪（标记X、Y、Z），每间隔一周，在连续的奶酪生产季节，由同一生产商生产的。
所有的奶酪都是在8℃下成熟的，重20kg，除了S和T以外，其余都是在当天生产采集的样品。
非发酵剂乳酸菌从奶酪中分离
在8周和17周的时候，10g的样品是无菌地从S和T的六个面（制定a-f））中取得的，例如面对一个相对c，b和e，f.采样点是在17周并没有在接近那些在8周的，每一单独的面（a-f）被无菌的2%型（w／v）柠檬酸三钠乳化，稀释，将1ml样品涂布于乳酸杆菌选择性琼脂培养基上，（LBS;
BectonDickinson,Cockeysville,MD,USA），用LBS覆盖，30°
C下培养5天，这一混合物是由乳化物1:
10稀释制成的，这种混合物被称为匀浆，匀浆就是上述所描述的全部了，十五个分离的的菌落，从每个中心中随机选取一个数板，和每个奶酪的匀浆在，在LBS培养基上划线，在MRS肉汤传播，纯化（Difco）。
X、Y、Z奶酪分别在成熟的第一周、第三周、六周、十三周、二十六周、三十九周取样。
在每个取样点所取得六个面的匀浆，十五个在每一时间段随机选择和纯化的菌落上述已论述完全。
所有菌株进行了测试，以确保他们的过氧化氢酶阴性，不运动的杆菌。
随机扩增多态性DNA鉴定菌株:
从1-5毫升在30°
CMRS肉汤一夜之间长大的细胞颗粒培养物中提取基因组DNA（Difco），采用RAPD方法，使用P1和P2引物和GelCompar4计划使用由此产生的带型聚。
（AppliedMaths,Kortrijk,Belgium）（Fitzsimonsetal.1999）。
物种名称是由奶酪的RAPD图谱与在表1中列出的收集菌株比较确定的（Fitzsimonsetal.1999），重复的RAPD和大量收集的菌株在70%的相似性分析整体表明，分离菌株是一脉相承的成员。
分离株的表型特征:
对奶酪X、Y、Z菌株的整体分析中产生的系统树图，进行研究后，一些菌株的物种名称是由所生理特性确定的，正如Fitzsimons等人先前所描述的（1999）。
结果
奶酪中的非发酵剂乳酸菌的空间分布
生长在切达奶酪中的乳酸菌在成熟过程中由最初的1×
cfu
到1×
，从而引发了一个问题这些细菌是如何分布整个奶酪中的。
菌株是有两块切达奶酪的每个面中心取得的（15每核心），称作S、T，存放了8周和17周的奶酪，是在八周和十七周成熟期，以及不同菌种产生的频率后从而被决定了。
在八周和十七周的每一个面样品中平均的数量是5×
（±
0.31）和1×
0.71）cfu
相对的，奶酪S和奶酪T在每一时间是8×
0.27），8周时奶酪中的不同菌株在表２中列出。
总共分离出来八株菌株，其中两种，菌株3和6，是在来自于每一个面的核心的不同水平，并且在六个面的匀浆中。
其他的菌株在每一核心中呈现不同的水平，给出一些例子，菌株７和菌株８只在一个核心中发现。
相同的结果在存放17周后的奶酪S和成熟8周和17周的奶酪T中获得了。
这些结果表明，主导菌群均匀呈现在奶酪中。
其它菌株也许也是均匀分布的，但是并未检测到，因为在每一
时间分离的菌株数目不够充足。
正如核心中的相同的菌株一样，匀浆也是占主导影响的。
这表明来自于一个面的核心与在奶酪中决定性菌株NSLAB的六个面的匀浆都是具有代表性的。
在成熟过程中的种群动态
X、Y、Z奶酪在成熟过程中NSLAB的变化呈现在图一中，奶酪Y中最初的数量
1×
和奶酪X中的数量1×
在下一个取样点（三周）增加到1×
，在下一个10周，三块奶酪中的NSLAB继续增长，直到增长到1×
。
在成熟的每一时间段内，15株由每三个奶酪中取得，共计270株。
268株的RAPD模式（在次培养基两次失败的生长）与已知的收集的菌株的比较在表1中列出。
结果如图2所示，含有奶酪菌株的集群被分配数量和那些含有收集菌株是指定的信件（assignedletter？
）。
来自于三块奶酪的菌株分为31群，大多数（79%）的菌株在副干酪乳的超星系团（supercluster？
）发现。
副干酪乳杆菌超星系团也显示出相当大的差异。
对多数副干酪乳杆菌株的采集和戊糖乳杆菌菌株、鼠李糖乳杆菌，植物乳杆菌和弯曲乳杆菌的收集，在这个非常大的超星系团的顶部除了副干酪乳杆菌超星系团。
菌簇2和4（图2）由于其生化特性被证实是鼠李糖乳杆菌，菌群5有一个非典型植物乳杆菌的表型，不能发酵纤维二糖，甘露醇或核糖。
代表菌团的7，8，9，13，14和19的联系表型缺失的副干酪乳杆菌，与他们的基因型特征一致。
没有物种名称可以被分配到31株的11（簇1和22±
31）；
然而，这些菌株只出现在第一个3周的成熟。
其中的七株（簇1，23，25，27和29±
31）只出现在奶酪中，然而其余部分（簇22，24，26和28）在两个奶酪的发生。
图一是乳酸杆菌的计数，奶酪X、Y、Z在39周成熟期中菌种的变化，■是菌落形成单位，◇是副干酪乳杆菌，○植物乳杆菌，△未知菌群
1周时，所有的奶酪的主导菌株株是无法确定的，从奶酪Z中分离的菌株，副干酪乳杆菌比例较小，而植物乳杆菌也被检测到了，正如在一周时，奶酪Z中检测到的较小比例的NSLAB从第六周开始每个奶酪中只包含副干酪乳杆菌除了13周的奶酪X，13周的奶酪X从中发现鼠李糖乳杆菌（如图1）。
奶酪成熟过程中的菌种动态变化
在奶酪X菌株分布在成熟过程中，Y和Z如表3所示。
共31中菌株，其中15个株副干酪乳杆菌。
六株（菌株7，9，10，13，18和21），占菌株的65%，出现在所有三个奶酪。
然而，这些相关大量的菌株在成熟期是十分丰富的，特别是在奶酪Z中。
八株（菌株14±
17，22，24，26和28），占19%的菌株，出现在两块奶酪中，其中的两种菌株22和24，分别在存放1周的奶酪Z和在3周的成熟奶酪x中发现大量的数量。
十七株（菌株1±
6，8，11，12，19，20，23，25，27和29±
31），占16%的菌株，只在一个奶酪中发现和每一次发现都只在同一个时间点。
这些数据表明，菌株比例代表由个别菌株在成熟中的变化。
奶酪X的菌群分布（表3）与奶酪Y和Z不同，在成熟过程中16株菌株没有一株被识别。
然而，从9和13株分离出的菌株被发现了三次，在两块奶酪中它们中的代表和其他菌株也被发现了。
奶酪中S和T进行菌群动态检测。
从匀浆被分为六个类群60株进行了RAPD分析，除了副干酪乳杆菌（表4）。
只有一个菌株，菌株2，在每个采样点在每个奶酪中都有的发现。
菌株4是在奶酪X的两个采样时间在和存放了8周的奶酪S中都发现了。
菌株3和5在17周的奶酪中都发现了，菌株1在是在奶酪S的两个时间出现了，而菌株6只出现在成熟17周的奶酪中。
图2节略的树状图，从伴随着P1和P2引物的随机组合的扩增多态性DNA模式中获得的，乳酸菌菌株的在三块成熟过程中爱尔兰切达干酪发现，用聚类分析和皮尔森积矩相关系（R）进行的非加权配对组法算术平均法
论述
通过生化手段测量大量的奶酪菌株的任务，特别是测定菌群水平是繁琐和费时的。
因此，必须用其他技术。
Cocconcelli等人（1997）利用RAPD和16SrDNA序列，研究嗜热乳酸杆菌群体的自然变化，在发酵剂被用于Parmesan干酪生产中。
RAPD被证明是非常适合在这方面的研究的。
在成熟的开始，NSLAB菌株的优势菌株是鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌以及无法确定的菌株，但这些菌株被非常迅速生长的副干酪乳杆菌取代，然后继续主导其余8个月的成熟。
它是很难找到副干酪乳杆菌在检测的五个干酪成熟过程中占优势的原因。
控制奶酪中的细菌生长的主要因素是相对较低的pH值和水分含量，低的氧化还原电位，和相对较高的NaCl浓度。
这些条件有利于植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌乳杆菌的生长。
事实上，在一个三者混合体系中，副干酪乳杆菌占主导地位的是不能理解的，但意味着参与促进该物种的增长有其他更微妙的因素。
所有的乳酸菌生长所需要的可发酵的碳水化合物。
乳糖是牛奶中的主要能量来源，然而迅速消失在奶酪最初的成熟的2周中（TurnerandThomas1980）。
对奶酪中的副干酪乳杆菌生长的能量来源是不明确的的，植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌不能在其中生长，因此不能在成熟的奶酪中成长。
植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌可能仍然在少数奶酪中生长，但是副干酪乳杆菌开始增加的数量，在本研究中使用的方法他们将不会被分离。
这些结果与Demarigny等人一致（1996），这表明，在生牛奶的瑞士奶酪成熟中，确定的菌株从开始成熟时的多样性，演变成两个后期制作24周的的副干酪乳杆菌的显著群体。
然而，目前的研究结果与早期的研究相反。
英国切达奶酪被认为占主导地位的植物乳杆菌和断乳酸杆菌缺失（NaylorandSharpe1958b）。
澳大利亚切达奶酪中含有植物乳杆菌和干酪乳杆菌（（FeaganandDawson1959），Coppola等人（1997）指出副干酪乳酸的在）帕尔马干酪整个成熟过程中，然而鼠李糖乳杆菌在Serra奶酪中是优势菌种（Macedoet等人。
1995）。
干酪乳杆菌是最常见的菌株在希腊凯发罗特里芝士奶酪（litopoulouT-zanetaki1990）。
没有分子技术被用来在这些研究中，这些不同的结果可能是由于在表型试验的解释的差异，特别是碳水化合物发酵。
奶酪是一种固体基质和生长的细胞会形成菌落，就像奶酪中的细菌没有或几乎没有运动。
此外，在开始成熟时，奶酪中的NSLAB密度很低（~1×
这些考虑引出了一些问题，NSLAB多少不同株出现在奶酪中和是否单个的菌种是均匀分布的。
结果在表2表明，一个或两个菌株在的各个核心占主导地位，但一些核心包含着对于核心独一无二的菌株。
这些菌株的影响范围可能是由于一些NSLAB菌落在特定的生境中生存的能力所决定的，例如通过更耐盐或能够本地化的盐水存活的或在最初成熟的干酪块中温度梯度变化，最有可能的是所有这些因素的组合。
Parker等人（1998）用光学显微镜和电子显微镜观察Serra奶酪的显微组织显示，紧凑的无菌的菌落出现在凝乳基质中，而混合品种的菌落是在凝乳交接处发现。
这些结果表明，微生物种群的组成不均匀地分布在整个Serra奶酪。
奶酪Y和Z中两株菌株占主导地位，但也包含在大量独特的菌株（表3）。
奶酪X是不同于奶酪Y和Z，由于它在整个成熟没有包含真正的优势菌株。
三块奶酪是在同一工厂制作1周后采集的。
这意味在一个工厂内仍然有显着的变化，这是由布鲁克等人的研究结果支持的于1999。
这些结果还表明，每个奶酪都有自己独特的微生物菌群，它们可能是是对不同批次的奶酪风味的多样性起主导作用。
需要进一步的研究以证实这一结论，因为目前所有的奶酪是在同一个工厂制造的，所以在各工厂之间的多样性变化是未知的。
本研究结果表明，一个独立的核心提供了干酪菌群代表，和包括六个面的复合样本都是具有代表性的然而，从统计的角度来看，大量的微生物群落代表是在一块奶酪中检测的，最好是将物种的数量和每一现存物种的数量记录下来NaylorandSharpe（1958a）推测，poolingcores和采取相关的复合材料，从而减少乳酸杆菌的不规则分布的影响，并且一个奶酪块中将会更具代表性。
本研究结果将否定NaylorandSharpe（1958a）推测的。
在70年代和90年代有不同的奶酪品种的微生物区系演化的研究，特别是手工伊比利亚奶酪（RomanPinÄ
ana1975;
OrdoÂ
nezandBurgos1977;
NunÄ
ez1978;
Poulletetal.1991,1993;
Medinaetal.1992;
Macedoetal.1996;
Cuestaetal.1996）.但一直对成熟奶酪的菌株水平和微生物种群的演变和进化过程没有深入的研究。
表3中的数据，显示一些奶酪中一个或两个菌株占主导地位的，但在成熟中也有相关的大量变化。
也有在成熟时，在一个特定的奶酪和一些特定阶段只检测到一些菌株的多样性。
这可能是由于这样的事实，只有15个菌株在每个采样点进行检测。
以更大的数量的菌株可能会增加的菌株的分离数量。
在成熟过程中只检测一次的菌株也很重要，因为，虽然他们只占了分离出来的一小部分，但是它们在奶酪中有高的数量，因为它们是从计数板中分离的。
总之，RAPD被发现是在从切达干酪分离物种和菌株水平的一种有效的方法成熟六周的三块奶酪中的乳酸菌群是由大部分不确定的菌株和此后主占优势的副干酪乳杆菌组成。
在成熟过程中，少数菌株在五块奶酪中的四块中起支配作用。
对三块奶酪的详细研究，在整个成熟期39周观察菌株的多样性和活力。
虽然有少数菌株重新出现的证据，多数菌株在奶酪只出现一次的。
致谢
这项工作是由欧洲地区发展基金的支持下，N.A.F的食品子项目测量3（II）。
感谢爱尔兰农业与食品发展部的沃尔什奖
参考文献：
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