分子生物学实验步骤总结超全Word文件下载.docx

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7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。

8）将DNA沉淀溶解于15ulTE缓冲液中，-20°

C保存。

9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。

植物DNA的SDS提取法：

（一）试验试剂：

1）研磨缓冲液：

称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。

2）10SSC溶液：

称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3）1SSC溶液：

用10SSC溶液稀释10倍。

4）0.1SSC溶液：

用1SSC溶液稀释10倍。

5）Rnase溶液：

用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6）氯仿－异戊醇：

按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7）5mol/L高氯酸钠溶液：

称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8）SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：

将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9）1mol／LHCl。

10）0.2mol/LNaOH。

11）二苯胺乙醛试剂：

1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：

H2O＝1：

50（V／V）］。

12）1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。

13）0.05mol/LNaOH。

14）DNA标准液：

取标准DNA25mg溶于少量0.05mol/LNaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

（二）实验步骤：

1）称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2）将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。

以4000rpm离心5min。

3）离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4）将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：

高氯酸钠溶液＝4：

1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5）再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6）用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。

此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7）然后加入0.5ml左右的10SSC，使最终浓度为1SSC。

8）重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9）加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10）加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11）再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

2、PCR扩增目的基因

（1）器材

1）微量移液器

2）灭菌的Tip头、PCR管

3）PCR扩增仪

4）目的DNA（DNA模板）

5）dNTP混合物

6）引物对

7）Tap酶

8）PCR扩增试剂盒

（二）试剂

1）10×

PCR缓冲液（含Tris-HCl100mmol/L;

MgCl215mmol/L、KCl500mmol/L,pH8.3，0.1%明胶）

2）脱氧核苷三磷酸dNTPs：

配成10mM——dATP，dTTP，dGTP，dCTP各10mM，用NaOH溶液调节至pH8.3。

）

3）氯仿-异戊醇：

配成24：

1的比例，室温避光保存。

4）酚：

异戊醇=25：

1

5）3MNaAc、ddH2O

6）无水乙醇：

70%乙醇

7）TE缓冲液

（三）实验步骤

1）在0.2ml薄壁反应管中加入下列成份：

（混匀）

ddH2O:

补至终体积（25μl）

10×

PCR缓冲液1/10总体积

2.0mMdNTPs1μl

2U/μlTaqDNA聚合酶0.5μl

引物混合液（10pmol/μl/引物）1μl

DNA模板0.6μl

混匀后，在台式离心机上瞬时离心10秒。

2）在设定好的PCR仪上反应

95°

C，5min；

C，1min；

56°

72°

C，2min。

反应30轮。

3）反应结束后，将反应管在72°

C充分延伸10分钟，再将反应管冷却至4°

C。

取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳（实验三），确认是否有目的的PCR产物。

如果PCR产物纯度较低或反应液中含有连接反应阻碍物，可以通过纯化得到改善。

纯化继续4）—6）。

4）转至1.5ml离心管，向管中加25μl酚，25μl氯仿-异戊醇混匀，离心10000rpm，30秒。

5）吸取上层液，转至另一已加5μl3MNaAc的1.5ml的离心管，加150μl无水乙醇，-20°

C过夜。

6）离心10000rpm，10分钟，弃上清，加0.5ml70%乙醇，10000rpm离心，5分钟。

弃上清，烤箱中干（60°

C），溶于20μlTE。

（四）技术要点

1）PCR各组份的配制与加样量要特别注意。

（1）引物浓度：

10pmol足够30个循环，浓度太高导致与模板非特异结合增强，扩增非特异片段增多，浓度太低则扩增效率低。

（2）引物的配制：

厂家提供的引物一般是干粉状态并标明OD值，1OD约含33μg。

开盖前先将干粉离心至管底，加双蒸水至浓度2μg/μl，再取部分稀释至10pmol/μl。

引物浓度计算公式：

1pmol=（3.3×

10-4μg）×

n，n是引物的碱基数

（3）Mg2+：

使用浓度一般在1.5mM，要求模板不含高浓度EDTA和诸如硫酸基团类的负电荷基团，Mg2+浓度升高可导致错配率升高和非特异性扩增。

（4）模板DNA：

浓度不可过高，质粒DNA20ng即可，若需第二次扩增，可将第一次扩增产物稀释1000-10000倍作为模板使用。

（5）TaqDNA聚合酶：

一般用量5U/100μl。

酶量过大易导致扩增非特异序列，Taq酶具有末端转移酶活性，常在3’端加A。

2）扩增轮数与退火温度

扩增轮数：

一般30轮以内就可使模板扩增106倍，超过30轮，错配率升高。

退火温度计算公式：

Tm值=（GC×

4+AT×

2）–4

3、琼脂糖凝胶电泳的检测

（一）仪器

1）琼脂糖凝胶电泳系统（天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、灭菌Tip头、水平电泳槽、电泳仪）

2）凝胶成像仪

（二）试剂及材料

目的DNA、琼脂糖、蔗糖、溴酚蓝、硼酸、Tris、EDTA、EB、DNA纯化试剂

盒

1）TAE电泳缓冲液

浓储存液50×

：

242gTris；

57.1ml冰乙酸；

100ml0.5mol/LEDTA（PH8.0）

定容至一升。

使用液1×

4.84gTris；

1.15ml冰乙酸；

2ml0.5mol/LEDTA（PH8.0）

2）样本液

10×

缓冲液:

60%蔗糖；

0.4%溴酚蓝

1）将有机玻璃内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，插好梳子，在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。

2）0.8%琼脂凝胶板的配制：

取0.6g琼脂糖加80mlTAE（1×

），20ml水，微波炉加热融化3分钟，将其冷却至55°

C-65°

C，加入EB储存液1ul，小心混匀，缓慢倒入制胶槽中。

（根据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度）。

3）充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，加入TAE（1×

），使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。

4）DNA样品按照10：

1的比例加入样本液，在腊面纸上混匀，用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。

同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔，在同一凝胶板上进行电泳。

5）接通电泳槽与电泳仪的电源，维持稳压1-5V/cm（按照两极之间距离计算），电泳时间根据溴酚蓝指示剂迁移的位置来判断，当移动到距凝胶前沿1-2cm出停止电泳。

6）剥胶并在凝胶成像仪观察结果。

（四）技术要点

1）选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。

不同浓度琼脂糖凝胶及其可分离的线性DNA大小范围见下表1。

表1不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子的有效范围凝胶浓度（%）

分离DNA的有效范围（kb）

0.3

60～5

0.6

20～1

0.8

10～0.8

1.0

7～0.5

1.2

6～0.4

1.5

3～0.2

2.0

2～0.1

2）电泳中注意防止凝胶发热。

3）将电泳仪置稳压档，电压设置小于5V/cm（电极间的最小路径）。

随着电压的增加，琼脂

糖凝胶的有效分离范围缩小。

4）溴化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。

四、目的DNA的回收纯化

1）琼脂糖凝胶电泳系统

3）离心机

4）单面刀片

5）恒温水浴锅

1）DNA回收试剂盒

2）50×

TAE

3）ddH2O

1）在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖．放入1.5ml离心管中。

2）按每100mg琼脂糖加入300—600μl溶胶液的比例加入溶胶液（本实验加500ul），置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。

3）将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体．再将吸附柱放入同一个收集管中。

4）在吸附杜中加入500uI漂洗液，室温静置1分钟后，12000rpm室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

5）再在吸附柱中加入500uI漂洗液，12000rpm室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。

6）12000rpm室温空离心1分钟。

7）将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后，12000rpm室温离心1分钟（为提高回收效率可再洗脱一次），将1.5ml离心管（DNA）贮存于-20℃。

五、限制性内切酶消化、产物回收及连接重组

（一）仪器及材料

1）回收得到的目的DNA

2）BamHI、HindIII、T4DNA连接酶、DNA回收试剂盒

3）pUC18‐CAT质粒、双蒸水、10×

酶切通用缓冲液K

4）EP管、恒温水浴锅、微量移液器、台式离心机

表1常用酶切缓冲液配方

缓冲液名称

配方

贮存温度（℃）

L

100mMTris-HCl,pH7.5

100mMMgCl2

10mMDTT

-20

M

500mMNaCl

H

500mMTris-HCl,pH7.5

1000mMNaCl

K

200mMTris-HCl,pH8.5

100mMMgCl2

1000mMKCl

T（BSA－Free）

330mMTris-Ac,pH7.9

100mMMgAc

5mMDTT

660mMKAc

0.1%BSA

0.1%TritionX-100

（二）实验步骤

1）在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系：

酶切反应体系（20ul体系）

管号核酸10×

酶切通用缓冲液KddH2OBamHIHindIII

115ul目的DNA2ul0ul2ul1ul

210ulpUC18‐CAT质粒2ul5ul2ul1ul

2）37℃保温三小时。

3）酶切产物的纯化回收，每100ul溶液加入700ul溶胶液，其余的操作步骤详见实验四

4）载体与目的DNA的连接。

在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反应体系（20ul）：

目的DNApUC18‐CAT质粒10×

连接缓冲液T4DNA连接酶ddH2O

XulYul2ul1ulZul

目的DNA和pUC18‐CAT质粒的相对浓度约为1:

3—1:

10

5）14℃水浴保温过夜。

6、大肠杆菌感受态细胞的制备及目的DNA的转化

1．小型高速离心机

2．恒温摇床

3．恒温培养箱

4．‐20℃冰箱

5．恒温水浴器

6．超净工作台

7．高压灭菌锅

（二）材料

1．氨苄青霉素

2．大肠杆菌DH5a

3．连接产物

4．离心管

5．枪头、微量移液器

6．试管、培养皿、三角瓶

（三）试剂

LB培养基（根据需要确定配制的量）：

10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，加水至1000ml，高压灭菌，保存在室温。

氨苄青霉素：

用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存。

卡那霉素：

用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存

无抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：

10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，15g/l琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；

铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。

含有抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：

当培养基降温至50℃左右，加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素或50μg/ml卡那霉素，并铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。

0.1MCaCl2（根据需要确定配制的量）：

11.099克溶解在1000ml灭菌水中，0.22μm滤器过滤除菌。

氯化钙分子量为：

110.99。

50％甘油：

50ml甘油加入50ml水，混匀，高压灭菌。

其他：

DH5α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加250mlLB液体培养基的1000ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml和500mL离心管若干，灭菌刻度吸管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。

（四）实验步骤

1）以接菌环从－70℃保存的高效转化菌种中蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12小时；

2）挑取单菌落接种于5mL无抗生素LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

3）按照1:

100接种菌液至250mLLB培养基中，37℃剧烈振荡培养1.5-2小时左右，至OD600达0.4-0.6；

4）将菌液冰浴10分钟，转移至预冷的500mL离心管中，4℃，4000rpm离心10分钟；

5）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于50mL预冷的0.1MCaCl2中，冰浴20分钟，4℃，4000rpm离心10分钟；

6）弃尽上清。

以12.5mL（菌液体积的5％）预冷的0.1MCaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入等体积预冷的50%甘油水溶液，混匀后按每支50μL在冰上分装，－80℃保存；

注：

以上操作全部在无菌条件下进行。

7）取连接产物2μl（在实际操作中，经常需要取全部连接产物）置于冰上；

8）从－80℃冰箱取3管感受态细菌（每管50μl），在冰上融化；

9）将连接产物加入感受态细菌中，混匀，放置冰上20－30分钟；

同时做两个对照管

•受体菌对照：

50μl感受态细胞+2μl无菌水

•质粒对照：

50μl0.1MCaCl2溶液+2μl连接产物

10）42℃加热90秒，迅速置于冰上1－2分钟；

11）每管加入400－1000μl的无抗生素液体LB培养基，在37℃摇床缓慢摇荡20－60分钟；

12）用<

10000rpm离心10秒，弃去大部分上清，留下约50μl并用移液器吹吸重悬细菌；

13）取适量细菌悬液均匀的涂布在带有相应抗性（根据质粒所携带抗生素抗性基因而定）的LB琼脂糖平板上，倒置于37℃培养箱培养12小时以上，出现菌落。

（五）技术要点

1．加入的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5％；

2．42℃热激时，必须要保证温度的准确性；

3．涂布LB平板的菌液量应该根据经验确定。

如果连接效率很高，而且所用感受态细菌的效率也很高，则吸取较少量的菌液；

反之，可以增加，甚至全部菌液涂布平板。

判断的标准：

在LB平板上生长密度合适的单菌落；

4．涂布平板之后，在37℃培养的时间不超过12－16小时，否则可能产生卫星菌落；

5．防止其它质粒污染；

6．防止其它细菌污染。

7、质粒DNA的提取及重组子的鉴定

1．恒温培养箱

3．小型高速离心机

4．高压灭菌锅

5．分光光度计

（2）试剂及材料

1.转化重组子

2.缓冲液A：

50mM葡萄糖；

10mMEDTA；

25mMTris-HCl，pH8.0。

3.碱溶液：

0.2MNaOH;

1%SDS,PH12.5。

4.乙酸缓冲液：

3MNaAC；

2M乙酸，pH4.8（盐酸调pH）。

5.TE缓冲液：

10mMTris-HCl，pH8.0；

1mMEDTA.。

6.RNA酶A溶液：

10mg/mlRNA酶A，用TE配制，100°

C煮10分钟，灭活DNA酶。

缓慢冷却至室温，10000r/min离心5min,上清于-20°

7.LB培养基:

10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5gNaCl加水至1000ml，用1MNaOH调pH至7.5，高压灭菌。

8.氨苄青霉素：

9.LA培养基:

在LB培养基中加入终浓度100μg/ml的氨苄青霉素。

10.异丙醇

11.酚-氯仿-异戊醇：

25：

12.70%乙醇

13.3MNaAc

1）从转化平皿上挑一克隆接种到LA液体培养基中，37℃震荡培养，待细菌浓度增至OD600=1—1.2时，收获细菌。

菌液转到1.5mlEppendorf管中，离心8000rpm，2分钟，弃上清。

2）加100μl缓冲液A，充分混悬细菌。

3）加200μl碱溶液，裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。

4）加150μl乙酸缓冲液，反复倒转管5次，混匀，冰浴10分钟。

5）离心10000rpm，5分钟，将上清转移至另一Eppendorf管中。

6）加等体积的酚-l氯仿-异戊醇（25：

1）混匀，离心10000rpm，1分钟。

7）吸上层水相至另一Eppendorf管中，加等体积的氯仿混匀，离心10000rpm，1分钟。

8）吸上层水相至另一Eppendorf管中，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温或-20°

C，10分钟。

9）离心10000rpm，10分钟，弃上清，加入1ml70%乙醇。

勿混匀，离心10000rpm，5分钟，重复加入1ml70%乙醇一次，弃上清，干燥箱中干燥。

10）干燥后，加入30μlTE（含RNA酶A10ul，20μg/ml），使质粒溶解，-20°

C保存备用。

11）取一个灭菌的EP管，依次加入下列试剂

限制酶缓冲液2.0ul、重组质粒5.0ul、ddH2O11.0ul、限制性内切酶2.0ul总体积为20.0ul。

12）将上述试剂轻轻混匀，稍加离心，集中溶液，37°

C水浴保温3—4小时。

酶切结束时，加入0.5mmol/LEDTA（PH8.0）使终浓度达10mmol/L，以终止反应。

13）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析详见实验三。

（四）技术要点

1）每一步都要充分混匀，为获得高产量DNA，第一步需使菌体完全重悬。

2）加入碱溶液后，反复混匀使细菌充分裂解，但需要轻柔，一旦裂解（液体变清亮）必须马上加乙酸缓冲液中和。

3）70%乙醇洗涤时，离心后应小心地将上清倒掉，注意这时DNA沉淀较疏松，易从管壁上脱落。