种子引发课题组实验步骤教材Word文档下载推荐.docx
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外箱
老化后种子水分
种子重量（g）
箱数目
老化温度
老化时间（h）
40.0
2
45
72
26-29
2方案2
热水浴老化法（HotwateragingmethodHW）：
一定量的种子放入到小网袋内，将装有种子的网袋放入到58±
1℃的水浴锅中，60min后取出晾于室温，风干到自然含水量。
邸宏,吕婷婷,刘玲玲,等.不同人工老化法测定玉米种子耐储性的比较分析[J].玉米科学,2015,23（3）:
71-75.
（二）正式试验
1种子引发处理
在垫有两层滤纸经过灭菌的培养皿中，加入浓度为0.1mmol/L的SA溶液10mL，每个浓度有3个重复，每个培养皿均匀摆放50粒种子（腹沟向下，种胚向上），加盖后用封口膜密封，在15℃黑暗引发36h，引发结束后，用蒸馏水将种子快速冲洗三遍，滤纸吸干种子表面水分，种子放于室温下回干至原始含水量。
以未进行引发处理的种子作对照
2种子干旱胁迫下吸胀发芽
选取籽粒饱满、均匀度一致的郑单958玉米种子进行培养，未进行引发处理的种子作对照，种子使用0.1%HgCl2消毒15min，并用蒸馏水冲洗干净将引发和对照种子依次摆放在垫有两层滤纸经灭菌后的培养皿中。
培养皿中加入11mL浓度15%的PEG-6000溶液。
放在25℃下吸胀萌发7天，逐日记录种子根和芽的生长情况，统计发芽率，发芽势并计算发芽指数、平均发芽日数和活力指数。
3种子吸胀期间生理生化指标测定
将引发和未引发种子依次摆放在垫有两层滤纸经灭菌后的培养皿中。
引发和对照种子在培养皿中均加入11mL浓度15%的PEG-6000溶液，引发和对照种子在培养皿中加入等量蒸馏水作为对照，每个处理设置3次重复，分别吸胀0、12、24、36、48h后，取出种子用滤纸将表面水分吸干，用刀片将引发和对照种子的种皮、胚和胚乳切割开并分别称取一定的重量，分别测定各项指标。
3.1可溶性蛋白含量的测定
一、实验目的与要求
植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢的一个重要指标。
考马斯亮蓝G-250染料结合法是常用的蛋白质测定方法之一。
通过本实验学习考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理及方法。
二、实验原理
考马斯亮蓝G-250是一种染料，游离状态下呈棕褐色，与蛋白质结合后变成蓝色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm，蛋白质含量0～1000μg·
mL-1范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量呈正比，故可用比色法测定。
考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合2min左右即达到平衡，完成反应十分迅速。
其结合物在室温下1h内保持稳定。
该反应非常灵敏，可测微克（μg）级蛋白质含量，是一种常用的蛋白质快速微量测定法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定的差异。
三、实验材料与用具
1.材料：
新鲜或烘干的植物种子。
2.器材：
分析天平；
试管（10mL）；
吸管（0.1mL、1mL、5mL）；
研钵；
漏斗；
离心管（10mL）；
容量瓶（10mL）；
离心机；
分光光度计
3.试剂：
（1）标准蛋白质溶液：
称取100mg牛血清蛋白，溶于蒸馏水并定容至100mL，制成1000μg·
mL-1的母液；
取出10mL该溶液，用蒸馏水稀释成100μg·
mL-1的母液。
（2）考马斯亮蓝G-250试剂：
称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL95%的乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，此溶液可以在常温下放置一个月。
四、实验方法和步骤
1.标准曲线的制作
（1）0～100μg·
mL-1蛋白质标准曲线的制作
表2-10～100μg·
mL-1蛋白质标准液的配制
试剂（mL）
1
3
4
5
6
0～100μg·
mL-1蛋白质标准溶液
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水
马斯亮蓝G-250试剂
蛋白质含量（μg·
mL-1）
20
40
60
80
100
取6支试管，按表2-1数据配制0～100μg·
mL-1牛血清蛋白溶液各1mL。
准确吸取所配各管溶液0.1mL，分别放入10mL具塞试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250试剂，盖塞，将试管中溶液重复摇匀，静置2min后，在595nm下比色（比色应在1h内完成）。
以牛血清蛋白含量（μg·
mL-1）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
（2）0～1000μg·
取6支试管，按表2-2数据配制0～1000μg·
与步骤
（1）操作相同，绘制出0～1000μg·
mL-1的标准曲线。
表2-20～1000μg·
0～1000μg·
200
400
600
800
1000
2.样品中蛋白质含量的测定
（1）称取0.1g种子干样品，放入研钵中，放入少许石英砂，加5mL蒸馏水或磷酸缓冲液在冰浴中研成匀浆，10000r离心10min，将上清液倒入10mL容量瓶，定容至刻度。
（2）另取1支试管，准确加入0.1mL样品提取液，再加0.9mL蒸馏水、5mL马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595nm波长下比色，记录吸光度。
五、结果与分析
根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量，按下公式计算：
六、注意事项
1．由于此法十分灵敏，所用容器必须清洗干净，取量准确，否则会造成大的误差。
2．比色应在出现蓝色2min～1min完成。
3.2种子可溶性糖含量SS的测定（蒽酮法）
掌握蒽酮法测定种子中可溶性糖含量的原理和技术。
糖类（包括单糖、双糖、寡糖）在浓硫酸存在下，脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，然后蒽酮与糠醛或羟甲基糠醛经脱水缩合，生成蓝绿色的糠醛衍生物，其在可见光区620nm波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的浓度成正相关。
其反应式如下：
显色反应与反应温度、加热时间、反应系统中水和硫酸比例有关。
本实验通过控制反应系统中水和硫酸比例，利用硫酸与水发生水合作用释放的热能，使反应系统自行升温而达到显色效果免去外加热步骤。
蒽酮法具有很高灵敏度，适用于糖的微量测定（含糖量在20～200μg范围内），且试剂简单，操作简便，因而得到普遍应用。
+3H2O
浓H2SO4
△
糠醛
戊糖
己糖
羟甲基糠醛
作物种子，烘干材料粉末（过筛100目）或剪碎混匀鲜样品。
2.器材：
分光光度计，烘箱，恒温水浴锅，电子天平，20mL具塞刻度试管，漏斗，20mL、50mL、100mL容量瓶，试管架，研钵。
（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：
称取分析纯蒽酮1g，溶于50mL乙酸乙酯中，贮存于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微加热使其溶解。
（2）浓硫酸（相对密度为1.84）
（3）100μg·
mL-1蔗糖标准母液：
将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。
加少量水溶解，转入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度，配成1%的蔗糖溶液。
精确吸取1%蔗糖溶液1mL加入100mL容量瓶中，加水至刻度，配成100μg·
mL-1的蔗糖溶液。
1.蔗糖标准曲线制作
表4-1各管号加入溶液量
试剂
管号
100μg·
mL-1蔗糖标准母液（mL）
蒸馏水（mL）
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
每管蔗糖含量（μg）
取6支试管，编号，按表4-1加入溶液和水，然后按顺序向试管中加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂和5mL浓硫酸，充分振荡，立刻将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在620nm波长下测定吸光值。
以吸光值为纵坐标，以蔗糖含量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，求出标准曲线方程。
2.可溶性糖的提取
称取0.10～0.30g切碎的鲜种子或粉碎的干种子样品，共3份。
分别放入3支20mL刻度试管中，加入5～10mL蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤到25mL容量瓶中，反复漂洗试管及残渣，定容至刻度。
3.糖含量测定
吸取样品提取液0.5mL于20mL刻度试管中，加蒸馏水1.5mL，以下步骤与标准曲线测定相同。
测定样品的吸光度，计算可溶性糖的含量。
式中c———标准方程求得的糖量（μg）；
a———吸取样品液体积（mL）；
V———提取液量（mL）；
n———稀释倍数；
m———样品质量（g）。
1．蒽酮反应颜色受温度和加热时间的影响，故须严格控制反应条件的一致性。
2．水浴加热时试管盖应该打开。
3．测定OD值时，比色杯内不能有水，否则比色液会发生浑浊。
4．蒽酮法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。
在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。
但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。
此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。
3.3单粒种子浸出液核苷酸含量测定
单粒种子浸出液核苷酸含量测定设置10个重复，每粒种子置于装有10mL去离子水的20mL试管中，将试管放置于25℃恒温培养箱中24h。
取3mL浸出液在260nm下测定其吸光度值。
参照Deswal和Sheoran的方法测定核苷酸含量，以每粒种子核酸量表示（μg核酸/种子）。
核苷酸浓度的计算公式为：
1OD=40μg∙mL-1（Deswal和Sheoran，1993）。
3.4种子过氧化物酶POD活性的测定（愈创木酚法）
通过本实验学习并掌握过氧化物酶（POD）活性测定的原理及方法。
过氧化物酶（POD）广泛分布于植物的各个组织器官中。
在植物细胞中，POD以两种形式存在，或以可溶性形式存在于细胞液中，或与细胞器相结合的形式存在。
本实验以愈创木酚（邻甲氧基苯酚）为底物，在POD的催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。
此产物在470nm处有最大吸收值，即可测得POD活性。
农作物、蔬菜、花卉、牧草种子。
高速冷冻离心机，分析天平，分光光度计，研钵，移液枪，磁力搅拌器，酸度计，秒表，离心管（5mL），烧杯，量筒，容量瓶等。
3.试剂：
（1）50mmol/L磷酸缓冲液（pH=6.7）：
先分别配置A液和B液，再使141.25mLA液和108.75mLB液混合，用蒸馏水定容至1000mL。
①A液（0.2mol/LNaH2PO4）：
准确称取31.202gNaH2PO4·
2H2O，用蒸馏水溶解，并定容至1000mL。
②B液（0.2mol/LNa2HPO4）：
准确称取71.70gNa2HPO4·
12H2O，用蒸馏水溶解，并定容至1000mL。
（2）0.1mol/LTris-HCl缓冲液（pH=8.5），准确称取12.114g三羟甲基氨基甲烷（Tris），加适量的蒸馏水溶解，用HCl调pH至8.5，稀释至1000mL。
（3）POD反应混合液：
50mmol/L磷酸缓冲液（pH=6.7）50mL，加入愈创木酚19μL，于磁力搅拌器上搅拌，直至愈创木酚完全溶解，再加入30%的H2O228μL，混合均匀，4℃保存。
1.粗酶液的提取
称取1.0g吸胀种子，加入5mL提取液0.1mol/LTris-HCl（pH=8.5），冰浴中研磨成匀浆后，于4℃以4000r/min离心15min，收集上清液保存于冷处，所得残渣再用5mL0.1mol/LTris-HCl（pH=8.5）提取一次，合并两次上清液，4℃保存备用。
2.酶活性的测定
取光径1cm的比色皿3个，1个作为零对照，另2个进行样品测定（2次重复）。
一只比色杯以1mL0.1mol/LTris-HCl（pH=8.5）做空白，加入POD反应混合液3mL，作为对照；
另2支比色杯均加入粗酶液1mL（如果酶活性过高可适当的稀释），再加入反应混合液3mL，立即开启秒表计时。
于分光光度计470nm波长下读取OD值，每隔1min读取一次，共测5min。
以每分钟OD470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位。
式中∆OD470——每分钟底物溶液吸光值的变化；
VT——粗酶提取液总体积（mL）；
V1——测定用粗酶液体积（mL）；
m——种子质量（g）；
1.酶液的提取应在低温下进行，预冷酶提取液和研钵，并在冰浴条件下研磨种子样品。
2.POD反应混合液也可用0.2mol/L磷酸缓冲液（pH=6.0）配置，其他成分浓度不变。
3.测定时如果酶活性太高，反应速度太快，可用pH=6.0的磷酸缓冲液稀释3～5或10倍（稀释倍数视情况而定）后进行。
3.5种子过氧化氢酶CAT活性的测定
通过本实验学习并掌握过氧化氢酶（CAT）活性测定的原理及方法。
过氧化氢酶（CAT）广泛分布于动植物和微生物中。
它能催化H2O2分解成水和分子氧，可使生物有机体免受过氧化氢的毒害。
测定CAT的方法有电化学法、高锰酸钾滴定法、分光光度计法、荧光分析法等。
本实验采用分光光度法。
利用CAT能促进H2O2分解，H2O2在240nm处有最大吸收峰，根据H2O2的减少量来表示过氧化氢酶的活性。
高速冷冻离心机，分析天平，分光光度计，恒温水浴锅，研钵，移液枪，磁力搅拌器，酸度计，秒表，烧杯，量筒，容量瓶（25mL）等。
（1）提取液：
50mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.0），含20%（V/V）甘油、1mmol/L还原型谷胱甘肽（GSH）、2mmol/L抗坏血酸和1%（m/V）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。
（2）0.1mol/LH2O2：
取11.36mL30%的H2O2，用水定容至1000mL。
（3）反应液：
10mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.8）。
反应液现配现用。
称取0.5g吸胀种子，加入2～3mL4℃预冷的提取液和少量石英砂，冰浴中研磨成匀浆后，转入25mL容量瓶中，并用提取液冲洗研钵数次，合并冲洗液，定容至刻度。
混合均与后将容量瓶置于4℃冰箱中静置10min，取上部澄清液于4℃以8000r/min离心15min，上清液即为酶提取液。
2.酶活性的测定
表13-1CAT活性测定试剂加入配置表
管号
酶提取液/mL
0.2（煮沸失活）
10mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.8）/mL
1.5
蒸馏水/mL
0.1mol/LH2O2/mL（25℃预热）
0.3
取10mL试管3支，其中1支作为对照，另2支进行样品测定（2次重复）。
按表13-1加入试剂。
每加完一管立即计时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定消光值，每隔1min读1次，共测4min，待3支试管全部测定完后，计算酶活性。
CAT活性以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活性单位（U）。
式中A0——加入煮沸失活酶液的对照管吸光值；
A1、A2——样品管吸光值；
mF——样品质量（g）；
0.1——A240每下降0.1为1个酶活性单位（U）；
t——加过氧化氢到最后一次读书时间（min）；
1．酶液的提取应在低温下进行，预冷酶提取液和研钵，并在冰浴条件下研磨种子样品。
2．CAT活性测定试剂加入配置表中的酶提取液可根据实验情况适量的增减。
实验十一种子超氧化物歧化酶活性的测定
一、实验目的与要求
通过本实验学习并掌握超氧化物歧化酶（SOD）活性测定的原理及方法。
超氧化物歧化酶（SOD）是需氧生物中普遍存在的一种含金属辅基的酶，是一种清除超氧阴离子自由基（
）的酶。
SOD酶有Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD3种类型，它们都催化下列反应：
由于超氧自由基（
）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般用间接方法，并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。
核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子
，当加入氯化硝基四氮唑蓝（NBT）后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲臜（黄色），继而还原生成二甲臜，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收，当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲臜生成速度减慢。
通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下个各液的光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，制作两者的相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。
找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50%时的酶量作为一个酶活力单位（U）。
1.材料：
高速冷冻离心机，分析天平，分光光度计，光照箱（4500lx）或荧光灯[光强约为83.3μmol/（m2·
s）]，微量进样器，玻璃质地和规格相同的试管，研钵，黑色硬纸套，酸度计，离心管（5mL），烧杯，量筒，容量瓶等。
（1）50mmol/L磷酸缓冲液（pH=7.8）：
先分别配置A液和B液，再使21.25mLA液和228.75mLB液混合，稀释至1000mL。
①A液（0.2mol/LNaH2PO4）：
准确称取31.2gNaH2PO4·
准确称取71.7gNa2HPO4·
（2）酶提取液
提取液A：
50mmol/LpH7.8磷酸盐缓冲液，含1%（m/V）聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。
提取液B：
50mmol/LpH7.8磷酸盐缓冲液，含0.1mol/LEDTA、0.3%（m/V）曲拉通（TritonX-100）和4%（m/V）PVP。
（3）130mmol/L蛋氨酸（Met）磷酸缓冲液：
准确称取L-蛋氨酸（C5H11NO2S，相对分子质量149.21）1.9379g，用磷酸缓冲液（pH=7.8）溶解，并定容至100mL，现用现配。
4℃冰箱中可保存1～2天。
（4）750μmol/LNBT（C4OH3OC12N10O6，氯化硝基四氮唑蓝，又称氮蓝四唑，相对分子质量817.60）溶液，准确称取0.1533gNBT，用磷酸缓冲液（pH=7.8）溶解，并定容至100mL，避光保存，现用现配。
4℃冰箱中可保存2～3天。
（5）100μmol/LEDTA-Na2（乙二胺四乙酸二钠，相对分子质量372.24）溶液，准确称取0.03722gEDTA-Na2，用磷酸缓冲
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