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生物化学实验
―教案―
侯沁文
实验一糖的颜色反应
[实验目的及要求]
1.掌握莫式（Molisch）试验鉴定糖的原理和方法。
2.掌握塞式（Seliwanoff）试验鉴定酮糖的原理和方法。
3.掌握杜式（Tollen）试验鉴定酮糖的原理和方法。
[实验原理]
1．莫式试验：
糖经无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与а-萘酚生成紫红色缩合物。
2．塞式试验：
酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应；
有时亦同时产生棕红色沉淀，此沉淀溶于乙醇，成鲜红色溶液。
3．杜式试验：
戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质。
[实验仪器及用品]
仪器：
水浴锅。
器皿：
吸管、试管。
实验药品：
蔗糖、葡萄糖、淀粉、果糖、阿拉伯糖、半乳糖、а-萘酚、浓硫酸、95%乙醇、间苯二酚、盐酸、间苯三酚。
[实验试剂]
莫式试剂：
а-萘酚5g,溶于95%乙醇并稀释至100ml。
现用现配，并贮于棕色试剂瓶中。
塞式试剂：
间苯二酚50mg，溶于100ml盐酸（VH2O：
VHCl=2:
1），现用现配。
杜式试剂：
2%间苯三酚乙醇溶液（2g间苯三酚溶于100ml95%乙醇中）3ml,缓缓加入浓盐酸15ml及蒸馏水9ml。
临用时配制。
[实验内容及步骤]
一、莫式实验
于4支试管中，分别加入1ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1ml水中），然后各加莫式试剂2滴，摇匀，将试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5ml（切勿振摇！
），硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。
二、塞式试验
于4支试管中，分别加入0.5ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%果糖溶液，然后各加塞式试剂2.5ml，摇匀，同时置沸水浴内，比较各管颜色及红色出现的先后顺序。
三、杜式试验
于3支试管中加入杜式试剂1ml，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，混匀。
将试管同时放入沸水浴中，观察颜色的变化，并记录颜色变化的时间。
四、实验现象记录
仔细观察实验中的颜色变化，对于塞式试验和杜式试验还需记录下颜色变化的时间。
实验二糖的还原作用
掌握糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。
费林（Fehling）试剂和本尼迪（Benedict）试剂均为含Cu2+的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O，此法常用作还原糖的定性或定量测定。
实验仪器：
水浴锅
实验器皿：
吸管、试管
实验试剂：
硫酸酮、氢氧化钠、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、无水碳酸钠、淀粉、蔗糖、葡萄糖。
1.费林试剂
试剂A：
CuSO4·
5H2O34.5g,溶于蒸馏水并稀释至500ml。
试剂B：
氢氧化钠125g，酒石酸钾钠137g，溶于蒸馏水并稀释至500ml。
临用时将试剂A与试剂B等体积混合。
2.本尼迪试剂：
柠檬酸钠（Na3C6H3O7·
11H2O）及50g无水碳酸钠，溶于400ml蒸馏水中。
另溶解8.5g硫酸铜于50ml热水中。
将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。
此混合液可长期使用。
于3支试管中加入费林试剂A和B各1ml，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。
另取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1ml，然后每支试管加本尼迪试剂2ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，和上面结果比较。
实验三多糖的实验
1．熟悉淀粉多糖的碘试验反应原理和方法。
2．进一步了解淀粉的水解过程。
淀粉广泛分布于植物界，谷、果实、种子、块茎中含量丰富，工业用的淀粉主要来源于玉米、山芋、马铃薯。
本实验以马铃薯为原料，利用淀粉不溶或难溶于水的性质来制备淀粉。
淀粉遇碘呈蓝色，是由于碘被吸附在淀粉上，形成复合物，此复合物不稳定，极易被醇、氢氧化钠和加热等使颜色褪去，其他多糖与碘呈特异的颜色，此类呈色物质极不稳定。
淀粉在酸催化下加热，逐步水解成分子较小的糖，最后水解成葡萄糖。
器材：
研钵、布氏漏斗、抽滤瓶、表面皿、白瓷板、胶头滴管、电炉、石棉网、纱布、试管、烧杯、吸管、量筒、试管夹。
试剂：
碘化钾、碘、淀粉、氢氧化钠、本尼迪试剂，浓硫酸、碳酸钠。
一、马铃薯淀粉的制备
将马铃薯去皮，在研钵中充分研碎，加水混合，用纱布过滤，除去粗颗粒，滤液中的淀粉很快沉到底部，多次用水洗淀粉，抽滤，滤饼放在表面皿上，在空气干燥中即得。
二、淀粉与碘的反应
1．置少量自制淀粉于白瓷板上，加1-3滴稀碘液（配制2%碘化钾溶液，加入适量碘，使溶液呈淡黄棕色即可），观察颜色变化。
2．取试管1支，加0.1%淀粉5ml，再加2滴稀碘液，摇匀后，观察其颜色变化。
将管内液体分成3份，其中1份加热，观察颜色是否褪去。
冷却后，颜色是否全部恢复。
另2份加入乙醇或10%NaOH溶液，观察颜色变化并解释之。
三、淀粉的水解反应
在一小烧杯中加入1%淀粉溶液25ml及20%硫酸1ml，放在石棉网上小火加热，微沸后每隔两分钟取出反应液2滴置于白瓷板上做碘试验。
与此同时另取反应液三滴，用10%碳酸钠中和后，做本尼迪试验，记录试验结果并解释之。
实验四糖的旋光性和变旋现象
[实验目的及要求]
1．了解糖的变旋现象，掌握用糖的旋光性测定糖浓度的方法。
2．学会使用旋光仪。
光是一种电磁波，光波振动的方向与光的前进方向垂直。
普通光的光波在各个不同的方向上振动。
但如果让它通过一个尼科尔（Nicol）棱镜（用冰洲石制成的棱镜），则透过棱镜的光就只在一个方向（偏振面）上振动，这种光就叫做平面偏振光。
偏振光能完全通过晶轴与其偏振面平行的尼科尔棱镜，而不能通过晶轴与其偏振面垂直的尼科尔棱镜。
当平面偏振光通过某种介质时，有的介质对偏振光没有作用，即透过介质的偏振光的偏振面保持不变。
而有的介质却能使偏振光的偏振面发生旋转。
这种能旋转偏振光的偏振面的性质叫做旋光性。
具有旋光性的物质叫做旋光性物质或光活性物质。
具有不对称结构的手性化合物都有旋光性。
能使偏振光的偏振面向右旋的物质，叫做右旋物质；
反之，叫做左旋物质。
通常用"
d"
（拉丁文dextro的缩写，"
右"
的意思）或"
+"
表示右旋；
用"
l"
（拉丁文laevo的缩写，"
左"
-"
表示左旋。
偏振光的偏振面被旋光物质所旋转的角度，叫做旋光度，用"
α"
表示。
旋光度的大小不仅取决于物质的本性，还与溶液的浓度、液层的厚度、光的波长、测定温度以及溶剂的性质等等有关。
偏振光通过厚度为1dm，浓度含有1g/ml的待测物质的溶液所测得的旋光度称为比旋光度[α]，它是物质的一个特性常数，如下式所示：
[α]λt=α/cl
式中t：
测定时的温度；
λ：
测定时所用光源的波长；
α：
实测的旋光度；
c：
溶液的浓度（g/ml）；
l：
玻管的长度（dm）。
一个有旋光性的溶液放置后其比旋光度改变的现象称为变旋。
变旋的原因是糖从α-型变为β-型或由β-型变为α-型。
一切单糖都有变旋现象。
无α-，β-型的糖类即无变旋性。
旋光仪、电子天平。
容量瓶、烧杯、玻棒。
未知浓度的蔗糖溶液、10%葡萄糖溶液。
一、利用糖的旋光性测定糖的浓度
1．转开样品管螺母，洗净玻管，然后向管中注满蒸馏水，盖上玻片，注意管中不能有气泡，玻片上的水渍必须擦干。
2．把样品放入旋光仪内，打开电源，待钠光源稳定1-2min后，转动刻度盘，使目镜中两半圆的亮度相等，记下刻度盘的读书，以此为零点。
3．用蔗糖代替蒸馏水测其旋光度，并按公式计算出蔗糖的浓度。
二、糖的变旋现象
用新配制的10%葡萄糖溶液按上法测其旋光度并计算比旋光度，以后每隔2h测定其旋光度，计算比旋光度直至比旋光度不再改变，说明α-，β-型互变已达平衡。
实验五血糖的定量测定（葡萄糖氧化酶法）
掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的原理和方法。
D-葡糖糖D-葡萄糖酸+H2O2
[实验仪器及试剂]
试管、移液管、UNICO-2000型分光光度计、恒温水浴锅。
酶试剂：
葡萄糖氧化酶（GOD）、过氧化物酶（POD）、4-氨基安替吡啉（4-AAP）。
酚试剂：
苯酚。
标准葡萄糖溶液：
100mg/dL（5.55mmol/L）。
[实验步骤]
按下表加入各反应物：
加入物（ml）
空白管
标准管
测定管
葡萄糖标准液
——
0.020
_____
血清样品
酶试剂
1.50
酚试剂
混匀，37℃保温15min，以空白管调零，505nm波长处测定各管吸光度值。
计算血糖含量=A样/A标×
标准溶液浓度
[实验注意事项]
1.分离血清要求使用未溶血样品，否则测定结果偏大。
2.要求在30min内分离血清，糖酵解在全血中以7%/h进行。
3.样本在4℃-8℃可稳定24h,样本放置时间过长会使结果偏低。
实验六人血清中总胆固醇的测定
学会利用氧化酶法测定血清中总胆固醇含量的原理和方法。
胆固醇脂+H2O胆固醇+游离脂肪酸
胆固醇+O2⊿4-胆甾烯酮+H2O2
2H2O2+4-AA+4-氯仿醌亚胺（红色）+4H2O
CEH：
胆固醇脂酶POD：
过氧化物酶
CHOD：
胆固醇氧化酶4-AA：
4-氨基安替吡啉
醌亚胺在500nm有特征吸收，且生成量与样本中的胆固醇含量成正比，可通过测定标准品反应生成的醌亚胺的吸光度值，计算出样本中胆固醇的浓度。
标准血清、样本血清、蒸馏水、酶试剂盒。
l
样本管
2000
蒸馏水
20
____
标准血清
样本血清
A500nm
各管混匀，37℃反应6min，以空白管校零。
实验七牛奶中粗脂肪含量的测定
学习和掌握粗脂肪的定量测定法─索氏提取法。
本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸发除去溶剂后称量。
整个提取过程均在索氏提取器中进行。
通常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为30º
C-60º
C的石油醚。
用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷脂、固醇、芳香油及某些色素等，故称为“粗脂肪”。
索氏提取器（如图所示）利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质连续不断地被纯溶剂萃取，既节约溶利萃取效率又高。
萃取前先将固体物质研碎，以增加固液接触的面积。
然后将固体物质放在滤纸套内，置于提取器中，提取器的下端与盛有溶剂的圆底烧瓶相连，上面接回流冷凝管。
加热圆底烧瓶，使溶剂沸腾，蒸气通过提取器的支管上升，被冷凝后滴入提取器中，溶剂和固体接触进行萃取，当溶剂面超过虹吸管的最高处时，含有萃取物的溶剂虹吸回烧瓶，因而萃取出一部分物质，如此重复，使固体物质不断为纯的溶剂所萃取，将萃取出的物质富集在烧瓶中。
索氏提取器、干燥箱、电子分析天平、滤纸、棉线、干燥器、烘箱。
全脂牛奶、无水乙醚或石油醚。
1、牛奶中水分含量的测定
准确称取一定量牛奶，吸附于70℃过夜烘干的层析滤纸上，70℃烘干后（约20分钟）称量，计算水分含量。
水分含量%=（M牛奶-M干物质）/M牛奶×
100%
M干物质=M带有干物质的层析滤纸-M层析滤纸
2、牛奶中粗脂肪含量的测定
将洗净的索氏提取器小烧瓶用铅笔在磨口处编号，103-105℃烘干2小时，取出，置于干燥器中冷却，然后用电子分析天平称重，并记录。
将测完水分含量带有干物质的层析滤纸用定性滤纸包裹，称量后置索氏抽提瓶，连接已干燥至恒重的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入无水乙醚，加量为接受瓶的2／3体积，恒温水浴加热，控制水温，以每小时回流3-5次为宜至抽提完全为止（用滤纸试）。
取下接受瓶，在水浴上蒸干乙醚，再于100℃～105℃干燥2小时，取出放干燥器内冷却30分钟，称重，重复操作至恒重。
取出滤纸包，于户外晾至无乙醚味，置入恒温箱内，烘干，然后移入干燥缸内冷却后称重，重复操作至恒重。
计算：
（1）粗脂肪含量%=（M提取前纸包-M提取后纸包）/M干物质×
（2）粗脂肪含量%=（M接受瓶+粗脂肪-M接受瓶）/M干物质×
[注意事项]
1、乙醚为易燃有机溶剂，实验室应保持通风并禁止任何明火。
2、抽提用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物，挥发残渣含量低。
因水和醇可导致水溶性物质溶解，如水溶性盐类、糖类等，使得测定结果偏高，被测样品也要事先烘干。
过氧化物会导致脂肪氧化，在烘干时也有引起爆炸的危险。
3、装样品的滤纸筒一定要严密，不能往外漏样品，但也不要包得太紧影响溶剂渗透。
放入滤纸筒时高度不要超过回流弯管，否则超过弯管的样品中的脂肪不能提尽，造成误差。
实验八牛奶中酪蛋白的提取
掌握一种提取酪蛋白及检测牛乳质量的方法。
酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，占乳蛋白的80%-82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。
它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。
它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质可以检测牛乳中是否掺假。
酪蛋白在其等电点（pH4.6）时由于静电荷为零，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调到pH4.6，酪蛋白就可从牛乳中分离出来。
酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白粗制品中将脂类杂质除去。
温度计、布氏漏斗、pH试纸、抽滤瓶、水浴锅、烧杯、量筒、表面皿、天平、离心机。
市售全脂牛奶、无水乙醇、无水乙醚、pH4.7乙酸钠缓冲液0.2mol/L。
1、酪蛋白等电点沉淀
将100mL牛乳放到500mL烧杯中，加热到40℃，加入到同样40℃的乙酸钠缓冲液中，调到pH4.7。
此时有絮状的蛋白质沉淀析出。
将悬浮液冷却至室温，放置分层，3000r/min离心15min，收集沉淀。
2、水洗
将pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍，洗涤粗制品三次，离心10分钟，得到沉淀蛋白。
3、去脂
向粗制品中加入10ml无水乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中，用乙醚-乙醇混合液洗涤沉淀两次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。
将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。
准确称重后，计算出每100mL牛乳所制备出的酪蛋白质量（g/100mL），并与理论产量（3.5g/100mL）相比较，求出实际获得百分率。
实验九牛奶中酪蛋白含量的测定
1、学会用紫外吸收光谱法测定核酸蛋白混合物中蛋白质含量的方法。
2、掌握A224.0nm-A233.3nm测定蛋白含量的原理和方法。
蛋白质中含有酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm波长处有最大吸收。
核酸及其衍生物有吸收紫外线的性质，其最高吸收峰在260nm处。
由于核酸在280nm处也有光吸收，因此当蛋白质和核酸共同存在时，测定其中任何一种物质均存在干扰。
核酸在230nm波长附近吸收值极小，如果将核酸测定值以230nm为中心，两侧存在对称而又相等的等吸收点，224nm波长处的吸收值和233.3nm波长处的吸收值相等。
蛋白质则不同，从240nm波长处向短波长处移动时，其吸收值对波长的减小吸收值呈线性增加。
因此，在240nm以下短波长一侧的核酸等吸收点中，如果测定蛋白质和核酸混合光密度值，两点间的光密度之差和蛋白质成比例关系。
该方法是格罗夫斯等1968年建立起来的，能够对浓度为5-180微克/毫升的样品作微量测定。
该方法有快速，灵敏，不破坏样品原有性质的优点，在测定完蛋白质含量后可用于其他分析。
试管、移液管、容量瓶、烧杯、玻璃棒、UNICO-2000型分光光度计。
pH7磷酸缓冲液。
用pH7的磷酸缓冲液溶解上次实验制得的酪蛋白，配置成5-180g/ml的溶液，测定其在224nm波长处和233.3nm波长处的光密度值。
按公式C蛋白质（mg/ml）=（A224-A233.3）×
210，计算浓度并反推回至每100ml牛奶中的蛋白含量。
1、在用紫外吸收光谱定量测定蛋白质时，280nm波长处蛋白质吸收光谱主要由色氨酸和酪氨酸引起，但在224-240nm波长处的紫外吸收谱不仅由这些氨基酸引起，与苯丙氨酸，组氨酸，蛋氨酸，胱氨酸及半胱氨酸也有关，因此与其他吸收紫外线的不纯物质共同存在时，就会受到显著影响，这一点也应引起注意。
2、pH值对核酸测定的等吸收点有影响。
实验十氨基酸的纸层析
了解并掌握氨基酸纸层析法的原理和方法。
用滤纸为支持物进行层析的方法，称为纸层析法。
纸层析所用的展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。
溶剂由下向上移动的，称为上行法；
由上向下的，称下行法。
将样品点在滤纸上，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。
由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，形成距原点距离不等的层析点，于是便将这些氨基酸分离开来。
溶质在滤纸上的移动速率用Rf表示：
Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离
只要条件不变，Rf是常数，故可根据Rf值作定性依据。
实验器材：
滤纸、烧杯、剪刀、层析缸、微量注射器（10l）、电吹风、722型分光光度计。
氨基酸混合液
碱相熔剂：
V正丁醇:
V12%氨水:
V95%乙醇=13:
3:
3
酸相溶剂：
V80%甲酸:
V水=15:
2
显色贮备液：
V0.4mol/L茚三酮-异戊醇:
V甲酸:
V水=20:
1:
5
[实验内容及步骤]
一、标准氨基酸单向上行层析法
1．滤纸准备；
2．点样；
3．展层和显色。
二、混合氨基酸双向上行纸层析
1.准备
3．展层和显色；
4．定性鉴定与定量测量。
三、数据记录和处理
1．计算出每种标准氨基酸的Rf值；
2．混合氨基酸的Rf值；
3．对照标准氨基酸的Rf值，指出氨基酸的名称。
１.
必须选用新华1号滤纸。
２.点样时，样点的直径不能超出0.5mm。
实验十一醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质
[实验目的]
学习醋酸纤维薄膜电泳的操作，了解电泳技术的一般原理。
醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法。
带电物质在电场力作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。
由于各种蛋白质都有特定的等电点，如将蛋白质置于pH值低于其等电点的溶液中，则蛋白质将带正电荷而向负极移动。
反之，则向正极移动。
因为蛋白质分子在电场中移动的速度与其带电量、分子的形状及大小有关，所以，可用电泳法将不同的蛋白质分离开来。
血清中含有多种蛋白质，它们的等电点都在pH7.5以下。
将血清置于pH8.6的缓冲液电泳时，所有的血清蛋白都带有负电荷，在电场中将向正极移动。
由于各种血清蛋白在相同pH时所带电荷数量不等，分子颗粒大小不一，因而泳动速度不同，经电泳被分离开来。
血清蛋白质的等电点和分子量见下表。
蛋白质名称
等电点（pI）
相对分子质量
清蛋白
4.88
690
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