纸层析法分离叶绿体色素方法的优化Word下载.docx

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Keywords:

Chloroplastpigment;

extraction;

separation;

chromatography;

effect

1引言

叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a（chla）、叶绿素b（chlb）、胡萝卜素和叶黄素组成。

从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。

分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等，纸层析是其中较简单的一种。

当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合色素中各种成分在两相（即流动相和固定相）间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的各种成分得到分离[1]。

但是，在使用传统方法提取和分离色素的过程中，仍然存在着使用较多的有毒试剂，如丙酮、CCl4等，层析时间长，分离效果较差，色带分布不明显等不足之处，。

所以，本文针对上述的缺点从材料的处理方法、提取液与层析液的选择等方面对提取和分离叶绿体色素的方法进行优化。

2研究方法

由于影响叶绿体色素层析实验效果主要有以下几个因素：

对材料的处理、提取溶剂的选择、层析剂的选择[2]。

所以，可以通过逐一改变其影响因素（其他的和对照组相同）的方法分别测出在这三个因素方面的最优良做法，组成一个优化后的分离方法。

2.1材料的处理方法

称取新鲜、去大叶脉的菠菜叶，按2g/组分三组，分别对这三组材料做一下处理：

（1）不处理（对照组）

（2）投入电炉上加热至沸的水中（30s-40s）后，立即放入冷水中（数秒），捞出后用吸水纸吸干水分[3]（3）在烘箱内（48℃）烘干约半小时[4]

2.2提取液的选择

（1）丙酮（对照）

（2）乙醇[5]（3）丙酮+石油醚（2滴）（4）乙醇+石油醚（2滴）[6]

每种提取液的总用量均为10mL

2.3层析液的选择

（1）CCl4+无水Na2SO4（对照）

（2）石油醚+CCl4（1/2）（3）石油醚+苯（3/1）（4）石油醚+苯（2/1）

3实验过程

3.1选择最优的材料处理方法

3.1.1制备叶绿体色素提取液

称取去大叶脉的菠菜叶，按2g/组分三组，分别对这三组材料做一下处理：

（1）直接研磨（不做任何处理），该为传统做法，对照组

（2）投入电炉上加热至沸的水中（30s-40s）后，立即放入冷水中（数秒），捞出后用吸水纸吸干水分（3）放入烘箱内（48℃）烘干半小时

待材料处理好以后，将处理好的材料剪碎放入研钵中，加入少量的CaCO3（中和细胞中的酸，防止Mg2+从叶绿素中释放）和石英砂进行研磨，成匀浆后再加入10mL丙酮，然后用漏斗过滤，得到三瓶叶绿体色素提取液，并标号。

3.1.2点样及做纸捻

取一张圆形滤纸，在圆心处开个孔，并在距离孔1cm处定三个点，分别标号。

然后用毛细吸管吸取三种提取液，分别对应点于圆形滤纸上的三个点上（一次不要点太多），然后用电吹风吹干，重复点样6-7次。

另将先准备好的长7cm，宽2cm的滤纸条卷成纸筒，用剪刀将纸筒一端剪成刷子状。

[7]

3.1.3层析

将做好的纸捻插入到圆形滤纸的圆孔上，让纸捻浸泡在CCl4+无水Na2SO4的层析液中进行层析。

等待20min，观察实验结果。

3.1.4结果

20min左右，三个点上的色素带已基本分开，观察圆形滤纸，得到2号点的条带分离效果最好，即通过投入到电炉上加热至沸的水中（30s-40s）后立即放入冷水中浸泡数秒，捞出后用吸水纸吸干水分的处理方法是最佳的。

3.2选择最优的提取液

3.2.1制备叶绿体色素提取液

在选出最优的材料处理方法后，按2g/组将去大叶脉的菠菜叶分成四组，用最优的方法处理四组材料，研磨成匀浆后，分别加入丙酮、乙醇、丙酮+石油醚、乙醇+石油醚四种提取液，均为10mL，过滤得到四种叶绿体色素液，并标号。

3.2.2点样及做纸捻

3.2.3层析

3.2.4结果

20分钟后，我们发现混有石油醚的提取液的分离效果较好，但由于丙酮有剧毒，为了安全，我们选择了4号提取液，即乙醇+石油醚。

3.3选择最适的层析液

确定了最优的材料处理方法和最佳的提取液，最后，我们再对层析液进行选择。

首先，称取2g的菠菜叶，去大叶脉，投入在电炉上加热至沸的水中（30s-40s）后，立即放入冷水中（数秒），捞出后用吸水纸吸干水分，然后将处理好的叶片剪碎并放入研钵中，研磨成匀浆，加入乙醇与2滴石油醚（共10mL）,过滤得到叶绿体色素液。

取出一张预先准备好的长7cm，宽2cm的滤纸条，用毛细管蘸取叶绿体色素液，在滤纸条的靠上方点上密集的点或划细线[8]，用电吹风吹干，重复点样6-7次左右，再将纸条卷成纸筒，用剪刀将下端没有点样的部分剪成小刷子状，做成纸捻。

一共做四个。

将做好的纸捻分别插入到已在圆心处开好孔的四张圆形滤纸上，同时分别进行层析，标号并记时，待层析完成之后，观察层析时间和层析的效果，我们得到层析液以石油醚+苯（3/1）比例混合的最佳。

4讨论

4.1从材料处理方面：

利用分光光度计对三种色素提取液进行测量，其结果如下：

（1）不处理：

A663=1.023；

A645=0.361

（2）沸水30s捞出：

A663=1.013；

A645=0.363（3）48℃烘干约半小时：

A663=0.925；

A645=0.328

从以上数据可以看出：

两组值中，1号与2号均较为接近，3号最小；

再结合层析得到的结果，可以判断出在材料1号与2号的方法对叶绿素的提取量较大，而2号的方法更有利于黄色素的提取。

4.2从提取液方面

通过观察层析结果，得到下表：

提取液

优点

缺点

‘*’级评价

丙酮

分离效果较好

时间较长，丙酮有剧毒

***

乙醇

价格低

层析效果差

**

丙酮+石油醚

提取较多的色素、分离效果较好、层析时间短

丙酮有剧毒

****

乙醇+石油醚

提取较多的色素、分离效果好、层析时间短、成本较低

无

*****

从上表可以得出这一结论：

在加了石油醚的提取液中，能提取出较多的色素，其中以黄色素最为明显。

虽然丙酮作为提取液的分离效果较好，但由于丙酮有剧毒，出于安全性的考虑，最终，本实验选择了乙醇+石油醚作为最佳的提取液。

4.3从层析液方面分析

实验所得数据可以制成下表：

层析剂

层析效果

所需时间

CCl4+无水NaSO4（对照）

一般

最长

石油醚+CCl4（1/2）

长

石油醚+苯（3/1）

较好

短

石油醚+苯（2/1）

最短

从上表可以看出在用石油醚和苯以2/1比例混合的层析剂时，在层析的时间最短、层析的效果也是最好的。

4.4注意事项

由于提取液所用药品都具有一定的挥发性，尤其是丙酮，所以，在研磨过程中要统一先将材料研磨成匀浆才加入提取液，否则会导致药品大部分发挥发掉了,药品损失,污染空气，同时因为挥发性的不同，也会影响实验的准确性。

[9]

点样时注意点样次数，确保点样的量尽量接近，以减小误差，保证实验数据的准确。

5结论

通过本实验，最终确定了一套从材料处理、提取液与层析剂的改进等方面较传统方法更优化的分离叶绿体色素的方法，即具体步骤如下：

（1）称取2g去大叶脉的新鲜菠菜叶，将其投入沸水中30-40s，捞出后立即放入冷水中，数秒后捞出，用吸水纸吸干水分。

（2）用剪刀将处理好的材料剪碎放入研钵中进行研磨，待成匀浆后加入乙醇与两滴石油醚，共10mL。

过滤，得到叶绿体色素提取液。

（3）点样：

用毛细吸管吸取提取液，在滤纸条的靠上方点上密集的点或划细线，（一次不要点太多），然后用电吹风吹干，重复点样6-7次。

（4）做纸捻：

再将纸条卷成纸筒，用剪刀将下端没有点样的部分剪成小刷子状，做成纸捻。

（5）层析：

将做好的纸捻分别插入到已在圆心处开好孔的圆形滤纸上，以石油醚和苯2/1比例的混合液作为层析剂，进行层析，19-23min后层析结束，得到清晰的色带。

6结束语

目前对叶绿体色素提取和分离方法的研究已经相当的广泛了，方法也是多种多样。

也有不少学者提出了许许多多的改良方法，在前人做过的大量实验中，有人从取材入手，通过几种材料对比而选出一种较好的材料；

有人从滤纸出发，将滤纸条改成灯芯状或用圆形滤纸代替；

还有人将层析溶剂加以改进，但实验效果仍不是很理想,原因是胡萝卜素及叶黄素含量低、色带浅。

一般情况下，各种植物叶片中的叶绿体色素总含量略有不同，但各种成分所占比例几乎是差不多的，叶绿素与类胡萝卜素的分子比例约为3/1。

倘若改变提取溶液成分使黄色素含量提高，层析的效果将大大提高，而石油醚利于黄色素的提取[10]。

为了提高黄色素含量，而采用石油醚，采用石油醚和丙酮的混合液提取，则能取得令人满意的效果。

但考虑到丙酮的毒性可能会对实验操作人员的安全性受到威胁，所有，本实验用乙醇代替丙酮，在实验效果上差别不大，又保证了实验操作人员的安全问题。

参考文献

[1].侯福林.植物生理学实验教程

[2].赵子峰，张亚丽，吕辉，郑蔚虹.叶绿体色素纸层析分离实验的关键步骤.生物学通报.2008,27

（1）:

0111~0115

[3]董少鸣,籍洪明,马鹏飞.几种植物材料叶绿体色素提取和分离的比较[J].承德民族师专学报,2002,（02）.

[4].赵子峰，张亚丽，吕辉，郑蔚虹.叶绿体色素纸层析分离实验的关键步骤.生物学通报.2008,27

（1）:

[5].黄伟，张梅.叶绿体中色素的提取和分离的改进[J].生物学通报.2003,（02）

[6].张素霞.菠菜叶中叶绿素提取工艺研究[J].中国植物与营养.2008,（5）

[7].苏运仁.叶绿体中色素的提取和分离的改进[J].湖北中小学实验室.1994,（03）

[8].康晓媛.“叶绿体中色素的提取和分离”实验的改进[J].中学生物教学.1999,（04）

[9].赵子峰，张亚丽，吕辉，郑蔚虹.叶绿体色素纸层析分离实验的关键步骤.生物学通报.2008,27

（1）:

[10].赵子峰，张亚丽，吕辉，郑蔚虹.叶绿体色素纸层析分离实验的关键步骤.生物学通报.2008,27

（1）:

致谢

在本次毕业设计过程中，从选题、构思、资料收集到最后定稿的各个环节吕亚慈老师给予我细心指引与教导，使我对植物抗旱有了深刻的认识，使我得以最终完成毕业设计，在此表示衷心感谢。

吕老师严谨的治学态度、丰富渊博的知识、敏锐的学术思维、精益求精的工作态度、积极进取的科研精神以及诲人不倦的师者风范是我终生学习的楷模。

导师们的高深精湛的造诣与严谨求实的治学精神将永远激励着我。

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在此我要表示衷心的感谢！

特别要感谢的是我的家人，一直给予我各方面的关怀和支持，让我茁壮成长。

最后，我要向在百忙之中抽时间对本文进行审阅、评议和参加本人答辩的各位师长表示感谢！

谢谢！