分子生物学实验指导Word格式.docx

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6． 

写作实验报告或实验论文一定要文理通顺、逻辑清晰、图表讲明详细，讨论分析透彻。

7． 

在实验室内不能大声喧哗。

8．在实验的过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面一角），严禁随地丢弃！

专门注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。

9．实验终止后要把用过的器皿清洗后归放整齐并清点数目，向教师汇报征得同意后方可离开实验实。

10．值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。

11．实验时损坏的任何物品都要及时申报。

实验一质粒DNA的提取

1．目的

学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。

2．原理

按照共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。

在pH12.012.5那个狭窄的范畴内，线性DNA双螺旋结构解开而被变性。

尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性，但两条互补链彼此互相盘绕，仍会紧密结合在一起。

当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液使pH复原中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，通过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。

3．器材

超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，1.5ml微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架，试管架，标签纸，磁力搅拌机。

4．试剂

pMD18-T-F载体菌，LB培养基1000ml（含100ug/ml氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA（GTE）溶液（溶液I），NaOH/SDS溶液（溶液II），KAc溶液（pH4.8）（溶液III），RNaseA，95%乙醇，70%乙醇，TEbuffer（pH8.0）。

5．实验预备

氨苄青霉素储存液（无菌水配制5mg/ml，分装后-20C储存），配制LB培养基（胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g加200mLddwater搅拌完全溶解，用约200L5NNaOH调pH至7.0，加ddwater至1L，121C20min灭菌）；

溶液I（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTrisHClpH8.0，10mmol/LEDTApH8.0）；

溶液II（0.2mol/LNaOH，1%SDS）；

溶液III（60mL5mol/LKac，加冰乙酸调pH4.8，补ddwater至100ml），70%乙醇（-20C储存），TEbuffer（10mmol/LTrisHClpH8.0，1mmol/LEDTApH8.0）；

10mg/mLRNaseA（RNA酶A溶于10mmol/LTrisHClpH7.5，15mmol/LNaCl中）；

摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121C30min）。

6．操作步骤

（1） 

在超净工作台中取5mlLB（Amp+），加入灭菌的摇菌管中。

（2）从超低温冰箱中取出储存pMD-18T-F的菌种（操作完后迅速把菌种放回超低温冰柜中，切不可将菌融解！

），在超净工作台上用烧红的接种环刮一下，再把接种环于无菌LB培养液（含100ug/ml氨苄青霉素）中搅拌一下，37C摇床中摇20h。

（3） 

取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中，15000rpm离心1min，弃上清液（尽量弃洁净），留沉淀备用。

（4） 

在沉淀中加入100l溶液I，盖上盖后赶忙在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。

（等待的同时，取一个塑料盒，装上适量的冰块备用。

）

（5） 

加入200l溶液II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

（6）加入150l溶液III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置5min。

（7） 

15000rpm离心5min，小心吸取400l上清液于另一个洁净的1.5ml离心管中，（不要将白色沉淀物带入！

），加入800l95%乙醇，盖上盖后赶忙在涡旋混合器上混匀，室温下静置5min。

（8） 

15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，加入500l70%乙醇，盖上盖后赶忙在涡旋混合器上混匀。

15000rpm离心10min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃洁净

（9）再加入500l70%乙醇，盖上盖后赶忙在涡旋混合器上混匀。

（10） 

离心管倒置于37C培养箱中（或室温）空气干燥。

（管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见！

（11） 

pMD18-T-F加入30l无菌蒸馏水或TE缓冲液，用记号笔标记后放入冰箱中备用。

（12） 

在剩余的菌液中倒入少许84消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下水池。

清理桌面，清洗仪器，撰写实验报告

7．摸索

阻碍本实验结果的因素有哪些？

实验二、质粒DNA的酶切

学会用限制性内切酶切割质粒DNA。

II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的专门序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。

pMD18-T-F质粒，EcoRI，BamHI，内切酶缓冲液（10×

），10×

电泳加样缓冲液

配制TAE电泳缓冲液（50储存液），1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）

（1）混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中：

pMD18-T-FDNA（或pUCm-T-F）6μL

10×

酶切缓冲液（用EcoRI的缓冲液）2μL

ddwater30μL

EcoRI1μL

BamHI1μL

总体积40μL

（2）先预备一个冰盒并放入一定量的冰块。

从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，赶忙插入冰块中。

（3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1μL限制性内切酶。

（4）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（赶忙把内切酶原液送回冰柜！

），轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。

再在离心机中1000rpm离心10秒。

取出后插到水漂的孔中，在举荐的最适酶切温度水浴中温育1-3h（一样是37℃）。

（5）酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA（如先前的PCR产物）对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。

（6）酶切后的质粒能够回收备用。

（7）清理桌面垃圾，清洗实验仪器。

撰写实验报告。

（1）酶切反应混合物的体积是否对酶切成效有阻碍？

什么原因？

（2）如何估量DNA用量和酶的用量？

（3）在吸取内切酶的时候如何操作才能别免白费？

实验三、质粒DNA的PCR扩增

学会PCR操作的差不多技术。

是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后通过耐热的DNA聚合酶延伸。

再进入下一轮变性—复性—延伸的循环，n次循环后DNA可被扩增（1+X）n倍。

其中<

25nt的引物退火温度Tm=2（A+T）+4（G+C）。

旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量管，双面微量离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。

3U/μlTaqDNA聚合酶，PCR缓冲液（10×

，MgCl2free），25mMMgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-F，无菌ddwater。

dNTP混合液（每种25mM），TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。

合成的引物：

Senseprimer5'

-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3'

Antisenseprimer5'

-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3'

目的基因模板质粒：

差不多克隆在pMD18-T-F载体上的781bpNDV-F基因。

待扩增的F片段长度：

837bp。

在0.2mlPCR微量离心管中配制50μl反应体系。

ddwater32μl

10×

PCRbuffer（不含MgCl2）5μl

25mMMgCl23μl

2.5mmol/LdNTP4μl（每种dNTP终浓度0.2mM）

10μmol/LPrimer12μl（12.5—25pmoles）

10μmol/Lprimer22μl（12.5—25pmoles）

模板质粒1μl（1×

10-3pmoles）

3U/μlTaq酶1μl（3u）

总体积50μl

（2）按照厂商的操作手册设置PCR仪的循环程序：

①94℃5min

②94℃1min

③60℃1min

④72℃1min50s

⑤goto②29times

⑥72℃10min

（3）PCR终止后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳。

观看胶上是否有估量的要紧产物带。

（4）清理桌面，撰写实验报告。

（1）复性温度如何确定？

（2）什么原因要在最后延伸10min？

（3）是否有非特异性扩增产物（或引物二聚体），如何才能排除？

实验四、DNA电泳鉴定

学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。

DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。

不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。

电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。

pMD18-T-F载体，TAE电泳缓冲液，1000溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，10加样缓冲液（或6加样缓冲液），DNA分子量标准（DNAHindIII:

23130，9420，6560，4360，2320，2030，560，130bp）。

配制TAE电泳缓冲液（50储存液，pH约8.5：

Tris碱242g，57.1ml冰乙酸，37.2gNa2EDTA.2H2O，ddwater定容至1L），1000溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：

50mg溴化乙锭溶于100mLddwater，4C避光储存），10加样缓冲液（20%Ficoll400，0.1mol/LNa2EDTApH8.0，1.0%SDS，0.25%溴酚蓝）；

6加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；

1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。

称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50mlTAE电泳缓冲液

（1），放入微波炉中烧开（1min）。

50ml正好倒两块小胶。

（2） 

注意观看烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！

戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60C）。

把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后慢慢倒入胶溶液。

胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到别处。

在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。

（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。

在水平电泳槽中加满1TAE电泳缓冲液。

按照电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V（10V/cm），注意正负电极的位置连接正确。

（6） 

待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。

用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。

凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。

剪1片光面纸（或封口膜），点6l蒸馏水、1l10加样缓冲液，再加入3l质粒DNA溶液制成10lDNA样品。

在凝胶上选择相邻的加样孔。

用10l的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3lDNA分子量标准物）。

加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。

看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）慢慢将蓝色的样品压入加样孔中。

切不可使蓝色样品流到孔外。

（9） 

打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发觉蓝色向后移动，赶忙关闭电源，调换电极）。

电泳将进行约30min。

（10）当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。

取出模具和凝胶。

把凝胶小心反扣放入盛有EB的搪瓷盒中。

放置约10分钟后，取出用自来冲洗两次。

放入凝胶成像系统中拍照。

清理垃圾。

染有EB的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。

（13） 

撰写实验报告。

泳道中的质粒DNA有几条带？

溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA?