热休克蛋白70Word格式文档下载.docx
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张川学号：
2011012028指导教师：
李东明职称：
副教授
1、论文（设计）研究目标及主要任务
研究目标：
在急性低氧刺激下，树麻雀肝脏组织中HSP70基因水平的变化。
主要任务：
分析低氧刺激对树麻雀HSP70基因水平的影响。
2、论文（设计）的主要内容
热休克蛋白是一种高度保守的应激蛋白，在受到外界刺激时，机体的HSP70会有一定变化，以保护组织器官等。
本研究以树麻雀为研究对象，研究其在低氧刺激下肝脏组织中HSP70基因的变化。
3、论文（设计）的基础条件及研究路线
基础条件：
本实验室主要研究动物对环境的适应性，具备研究树麻雀HSP70的基础条件，实验室仪器设备齐全，并具有野外取材的条件和能力。
研究路线：
将树麻雀放入模拟各种海拔高度低氧的环境生活一定时间，然后提取其肝脏组织，对肝脏组织中HSP70基因的mRNA表达量进行分析对比。
4、主要参考文献
[1] WelchWJ.Mammalianstressresponse:
cellphysiology,struc2ture/functionofstressproteins,andimplicationsformedicineanddisease[J].PhysiolRev,1992,72（4）:
1063-1081.
[2] Suzukik,SawaY,Kagisakik,etal.Reductioninmyocardialapoptosisassociatedwithoverexpressionofheatshockprotein70[J].BasicResCardiol,2000,95（5）:
397-403.
[3] 任宝波,王玉艳,王纯净,等.HSP70家族的分类及基因结构与功能[J].动物医学进展,2005,（26）:
98-101.
[4] IshiiT,VdonoH,YamanoT,etal.IsolationofMHCclassI-restrictedtumorantienpeptideanditsprecursorsasso2ciatedwithheatshockproteinsHSP70,HSP90andgp96[J].Immunol,1999,162:
1303-1309.
[5] 陈劲松.热休克蛋白的分子遗传学研究进展[J].国外医学一遗传学分,2001,24（3）128-132.
5、计划进度
阶段
起止日期
1
捕捉树麻雀
3.12-3.15
2
低氧处理树麻雀
3.16-3.17
3
HSP70基因的克隆及分析
3.19-3.21
4
RNA提取及反转录成cDNA
3.27-3.31
5
数据的分析和处理
4.1-4.3
指导教师：
年月日
教研室主任：
河北师范大学本科生毕业论文（设计）开题报告书
生命科学学院生物科学专业2015届
学生
姓名
张川
论文题目
急性低氧刺激下树麻雀HSP70等基因的适应性变化
指导
教师
李东明
专业职称
副教授
所属
教研室
动物生态学
研究
方向
资源与功能学
课题论证：
目前对HSP70的研究主要集中于哺乳动物，我们所采取的实验材料是树麻雀，以增强对HSP70的了解。
本实验是将野外捕捉的树麻雀通过不同程度的急性低氧刺激后，提取其肝脏组织中的HSP70mRNA来进行定量分析。
本实验室仪器设备齐全，具备完成实验的条件。
通过实验，我们将对HSP70在鸟类中的表达有更深的认识。
方案设计：
对越冬晚期的树麻雀分组进行低氧处理（对照组、3000米8小时、3000米24小时、6000米8小时、6000米24小时），然后对树麻雀肝脏组织进行取材，克隆HSP70基因并进行分析。
提取肝脏组织RNA并反转录成cDNA。
对其数据进行分析。
进度计划：
1、3月中旬捕捉越冬晚期的树麻雀
2、3月16日-3月17日，低氧处理树麻雀
3、3月19日-3月21日，对树麻雀HSP70基因进行克隆和分析
4、3月底，提取肝脏组织RNA并反转录成cDNA。
5、4月1日-4月3日，分析处理数据。
指导教师意见：
指导教师签名：
教研室意见：
教研室主任签名：
河北师范大学本科生毕业论文（设计）文献综述
1962年，Ritossa在果蝇唾液腺中意外的发现了热休克蛋白（HSPs）。
它具有分子伴侣功能，并不参与细胞中蛋白质的折叠合成，而是减小蛋白质折叠过程中出现的错误，维持蛋白质的稳定性。
热休克蛋白几乎存在于所有生物体内的各种细胞中。
在正常情况下，热休克蛋白表达的并不多。
而当细胞受到刺激或损坏时，热休克蛋白会迅速的大量表达，以保证细胞内蛋白质的稳定性，维持机体的正常生理功能（WeiJ.Gong等，2005）。
在外界刺激下，热休克蛋白协助细胞内的蛋白质正确的折叠，保持其稳定性，以防止细胞内蛋白质损坏。
研究发现，在对动物的多种刺激（如：
高温、缺氧、炎症、感染、紧张等）下，这种新发现的蛋白，都能对细胞内的蛋白质有一定的保护作用。
在热休克蛋白家族中，热休克蛋白70（HSP70）是诱导产生最多的一种应激蛋白。
HSP70家族基因结构高度保守，大鼠与人的HSP70氨基酸序列同源性为95%,与小鼠的同源性为98%。
氧在动物的生命活动中具有至关重要的作用。
在低氧或无氧环境下，绝大多数动物的新陈代谢受到抑制、细胞出现损伤，出现程序性死亡（曾涛等，2012）。
急性低氧刺激下，有机体细胞的生理机能会受到损害。
为了减小损伤，动物会依靠自身生理与代谢的调节，如增强心脏泵血、增加肺通气、增多血细胞、减小红细胞体积并增加数量、升高血红蛋白的浓度等（Marcusetal.,2009）。
研究发现，在缺氧时，热休克蛋白对动物心肌具有一定的保护作用。
HSP70可以保护心肌收缩，减少心肌缺血坏死范围，抗心律失常等作用（何巍等，2007）。
对细胞的程序性死亡有一定的抵抗作用，同时还具有协同免疫作用（李逢昌等，2007）。
以减少低氧刺激下，有机体的损伤。
对在低氧条件下动物的适应性变化的研究中，已经发现HIF-1、促红细胞生成素（ErythroPoietin，EPO）、血管内皮生长因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）、血红蛋白（Hemoglobin，Hb）等低氧相关基因及能量代谢过程中的限速酶，如琥珀酸脱氢酶（SuccinoDehydrogenase，SDH）、乳酸脱氢酶（LacticDehydrogenase，LDH）等（Ramirezetal.,1999）。
HSP70对肿瘤细胞的作用很复杂，它可以通过增强机体的免疫作用使肿瘤细胞产生细胞凋亡，同时又能像保护其他细胞一样，增强肿瘤细胞的免疫性（李建斌等，2008）。
由此，可以看出，HSP70对动物正常或非正常的细胞的作用是非常复杂的。
树麻雀（Passermontanus）隶属于雀形目、文鸟科，典型的伴人物种，广泛分布于不同环境。
树麻雀同哺乳动物一样，作为一种高等动物，它对各种环境都具有一定的适应性。
在对树麻雀进行不同程度和不同时间的低氧处理后（对照组、3000m-4h、3000m-8h、3000m-24h、6000m-4h、6000m-8h、6000m-24h），研究发现，树麻雀肝脏中的HIF-1α和VEGFmRNA表达量随低氧程度加剧与时间延长而显著升高（姚瑶等，2012）。
河北师范大学本科生毕业论文（设计）翻译文章
在低氧条件下关节处软骨细胞HIF-1ɑ诱导HSP70合成代谢反应
摘要：
我们评估在缺氧条件下关节处软骨细胞的合成代谢途径中，热休克蛋白70（HSP70）的参与是否依赖于缺氧诱导因子1ɑ（HIF-1ɑ）。
主要是把家兔软骨细胞分别在常氧（20%氧气条件）和低氧（1%氧气）条件下培养。
或者，家兔软骨细胞在常氧下培养时，用CoCl2进行处理诱导HIF-1ɑ的生成，以模拟缺氧条件。
或者在缺氧条件下通过转染siRNAs诱导HIF-1ɑ（si-HIF-1ɑ）和HSP70（si-HSP70）。
在缺氧或模拟缺氧条件下，HIF-1ɑ的表达增强使HSP70表达也增强了，但并没有si-HIF-1ɑ的存在。
低氧诱导ECM基因的超表达显著抑制si-HIF-1ɑ和si-HSP70的表达。
细胞活力与缺氧直接相关，但转染si-HIF-1α或si-HSP70废除了缺氧的软骨保护作用。
在缺氧条件下，虽然用硝普钠处理的细胞和TUNEL阳性细胞LDE的释放均降低，但转染si-HIF-1a或si-HSP70几乎完全阻断了这些效果。
这些发现表明HIF-1α诱导HSP70表达，增加了ECM基因的表达水平和细胞生存能力，并防止软骨细胞凋亡。
在缺氧条件下，HIF-1α可通过诱导HSP70的的表达进而影响软骨细胞的合成代谢。
关键词：
缺氧诱导因子；
热休克蛋白70；
低氧：
细胞外基质；
细胞凋亡。
讨论：
氧传感器之间存在一个监管环节与热休克通路。
该环节涉及上调热休克因子（HSF）的缺氧依赖性。
缺氧时HIF-1α引起HSF转录增加，以增加HSF的细胞丰度和增加的热休克途径的灵敏度的一种方法。
缺氧条件下，比起在果蝇KC167细胞或胫骨软骨发育不良的生长板上的热休克蛋白，用一个HSF的HIF-1α依赖性的方法，可让HSP70转录水平增加更多。
然而，在缺氧条件下仍不清楚关节处软骨细胞HSP70是否是由HIF-1α调节。
要确定HIF-1α是否影响HSP70的表达，我们对家兔关节软骨细胞在常氧，缺氧或低氧刺激下培养后HIF-1α、HSP70mRNA和蛋白水平的情况进行了分析。
我们观察到，在缺氧或模拟低氧条件下HSP70mRNA和蛋白质的水平比在常氧中更高，但是这都是由于HIF-1α灭活才产生的。
这些发现表明，软骨细胞缺氧时产生HIF-1α以调控HSP70的表达。
以前的研究已表明，在低氧诱导的靶基因缺氧反应元件处，HIF-1α与其结合位点结合，并与该处的HSP70启动子结合，以激活HSP70的转录表达。
软骨细胞在缺氧条件下，可能通过这种途径使HIF-1α诱导HSP70的表达。
HSP90对HIF-1α有稳定性的作用，并介导氧气独立泛素化和蛋白酶体降解。
缺氧导致HIF-1α转录因子增加，从而使HSP70和HSP90的表达水平增加。
进一步的研究需要弄清楚HSP的高表达是在软骨细胞死亡之前还是死亡之后。
在软骨细胞中HIF-1α对ECM代谢的影响的研究表明，在人体关节软骨细胞处，HIF-1α参与了诱导主要的ECM基因PG和ColII。
但是，这些ECM基因不是HIF-1α的直接目标，这表明，缺氧诱导产生的HIF-1α可间接增加软骨细胞ECM的合成。
虽然我们以前报道，HSP70参与PG的热诱导表达，低氧条件下HSP70对ECM表达的作用却仍不清楚。
为了确定在低氧条件下的软骨细胞HSP70表达是否影响细胞外基质代谢，我们还分析ECM基因，例如PG和ColII的mRNA水平。
我们发现PG和ColIImRNA的水平在缺氧条件下被显著增加，但不是通过si-HIF-1a或si-HSP70在细胞中转染的。
常氧条件下，这些基因也可被CoCl2刺激使表达增加。
这些结果表明，软骨细胞的细胞外基质代谢可通过HIF-1α诱导的HSP70来调节。
另一方面，在低氧条件下HIF-1a的调节对软骨具有保护作用。
我们已经报道了HSP70的表达，增强了软骨细胞的代谢活性，并对它们有热应激的保护作用。
我们观察到，si-HIF-1α或si-HSP70几乎完全取消了缺氧诱导的软骨保护作用，意味着HIF-1α诱导HSP70可能增加缺氧条件下软骨细胞的生存能力。
我们还报告说，软骨细胞中的HSP70过度表达抑制了NO导致的细胞凋亡。
在这项研究中，我们发现，缺氧条件下培养的软骨细胞可防止NO诱导的细胞凋亡，但转染si-HIF-1α或si-HSP70的这些细胞加速了NO诱导的细胞凋亡。
这些发现表明，在低氧条件下，HIF-1a和HSP70涉及的途径，可能参与应激诱导的细胞毒性的抑制。
主控调节基因SOX9也对软骨细胞的生存至关重要，直接调节主要软骨基质基因如ColII和聚集蛋白聚糖。
软骨细胞在缺氧条件下HIF-1α对SOX9的调节起着重要作用。
在软骨细胞中SOX9也与HSP70相互作用。
在这里，我们发现，HIF-1α诱导HSP70的表达增强了ECMmRNA和软骨细胞活力，并抑制了NO诱导的细胞凋亡。
这些发现表明，HIF-1α可调节HSP70和SOX9的相互作用。
患有关节炎的关节滑液（OA）比健康关节处的关节滑液氧含量要低。
软骨细胞中HIF-1a的含量升高与OA患者的关节慢性缺氧有关。
此外，软骨细胞中HSP70的表达水平也可能与OA的组织学严重程度相关。
然而,在OA患者软骨细胞处HIF-1a和HSP70的表达水平可能不够高,致使应激损伤软骨消除,导致这种疾病恶化。
控制HIF-1α诱导的HSP70表达可为OA患者提供一种新的治疗策略，但这个想法需要进一步检验。
总之，这项研究显示，HIF-1α肯定诱导了HSP70表达，至少部分地表明与HIF-1α依赖性合成代谢途径相关。
HIF-1a-InducedHSP70RegulatesAnabolicResponsesinArticularChondrocytesunderHypoxicConditions
ABSTRACT:
Weassessedwhetherheatshockprotein70（HSP70）isinvolvedinhypoxiainduciblefactor1alpha（HIF-1a）-dependentanabolicpathwaysinarticularchondrocytesunderhypoxicconditions.Primaryrabbitchondrocyteswereculturedundernormoxia（20%oxygencondition）orhypoxia（1%oxygencondition）.Alternatively,cellsculturedundernormoxiaweretreatedwithCoCl2,whichinducesHIF-1a,tosimulatehypoxia,ortransfectedwithsiRNAstargetingHIF-1a（si-HIF-1a）andHSP70（si-HSP70）underhypoxia.HSP70expressionwasenhancedbytheincreasedexpressionofHIF-1aunderhypoxiaorsimulatedhypoxia,butnotinthepresenceofsi-HIF-1a.Hypoxia-inducedoverexpressionofECMgeneswassignificantlysuppressedbysi-HIF-1aorsi-HSP70.Cellviabilitypositivelycorrelatedwithhypoxia,buttransfectionwithsi-HIF-1aorsi-HSP70abrogatedthechondroprotectiveeffectsofhypoxia.AlthoughLDHreleasefromsodiumnitroprusside-treatedcellsandtheproportionofTUNELpositivecellsweredecreasedunderhypoxia,transfectionwithsi-HIF-1aorsi-HSP70almostcompletelyblockedtheseeffects.ThesefindingsindicatedthatHIF-1a-inducedHSP70overexpressionincreasedtheexpressionlevelsofECMgenesandcellviability,andprotectedchondrocytesfromapoptosis.HIF-1amayregulatetheanaboliceffectsofchondrocytesunderhypoxicconditionsbyregulatingHSP70expression._2014OrthopaedicResearchSociety.PublishedbyWileyPeriodicals,Inc.JOrthopRes32:
975–980,2014.
Keywords:
hypoxia-induciblefactor-1a;
heatshockprotein70;
hypoxia;
extracellularmatrix;
apoptosis
DISCUSSION
Aregulatorylinkexistsbetweentheoxygensensingandtheheat-shockpathways.Thislinkinvolvesthehypoxia-dependentup-regulationoftheheat-shockfactor（HSF）.HIF-1acausesincreasedHSFtranscription
duringhypoxiaasameanstoincreasethecellularabundanceofHSFandincreasethesensitivityoftheheatshockpathway.8Underhypoxicconditions,HSP70transcriptlevelsaremoreincreasedinanHSF-orHIF-1a-dependentmannerthanotherHSPsinDrosophilaKc167cellsoringrowthplateofthetibialdyschondroplasia.8,9However,itremainedunclearwhetherHSP70isregulatedbyHIF-1ainarticularchondrocyteunderhypoxia.TodeterminewhetherHIF-1aaffectstheexpressionofHSP70,weanalyzedHIF-1aandHSP70mRNAandproteinlevelsinrabbitarticularchondrocytesculturedundernormoxia,hypoxia,orstimulatedhypoxia.WeobservedthatthelevelsofHSP70mRNAandproteinwerehigherunderhypoxiaandsimulatedhypoxiathanundernormoxia,butthattheseeffectswereabrogatedbyinactivationofHIF-1a.ThesefindingsuggestedthatHIF-1aregulatestheexpressionofhypoxiainducedHSP70inchondrocytes.PreviousstudieshaveshownthatHIF-1abindstotheHIF-1bindingsiteinthehypoxiaresponseelement（HRE）ofhypoxia-inducibletargetgenes,aswellastoaHREoftheHSP70promoter,transcriptionallyactivatingHSP70expression.17,18ThesepathwaymaycauseoverexpressionofHIF-1a-inducedHSP70inchondrocyteunderhypoxia.HSP90alsoplaysaroleinstabilizingHIF-1a,andmediatesO2-independentubiquitinationandproteasomaldegradation.HypoxialeadstoanincreaseinthetranscriptionfactorHIF-1a,causingincreasesinthelevelsofHSP70andHSP90.9FurtherexaminationisrequiredforinvestigationintowhetherthehighHSPexpressioninthisprecededorfollowedabnormalchondrocytecelldeath.
StudiesontheeffectsofHIF-1aonECMmetabolisminchondrocyteshaveshownthatHIF-1awasinvolvedinthehypoxia-inducedincreaseofPGandColII,themainECMgenes,inhumanarticularchondrocytes.19,20TheseECMgenes,however,arenotdirecttargetsofHIF-1a,21suggestingthatHIF-1amayindirectlyincreasehypoxia-inducedECMsynthesisinchondrocytes.AlthoughwepreviouslyreportedthatHSP70isinvolvedintheheat-inducedexpressionofPG,12theroleofHSP70inECMexpressionu
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