RACE实验服务.docx
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RACE实验服务
RACE实验服务
RACE(rapid-amplificationofcDNAends)简介
摘要:
RACE技术的简介cDNA完整序列的获得对基因结构、蛋白质表达、基因功能的研究至关重要。
完整的cDNA序列可以通过文库的筛选和末端克隆技术获得。
末端克隆技术是20世纪80年代发展起来的。
RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。
RACE的优点…【晶莱生物】
比较由GSP和NGSP获得RACE产物
对于5‘末端的RACE产物,比较由AP1和GSP1扩增出来的产物和由AP1和NGSP1扩增出来的产物。
对于3‘末端的RACE产物,比较由AP1和GSP2扩增出来的产物和由AP1和NGSP2扩增出来的产物。
这对于鉴定多条带是否是上一个PCR的特异性产物是非常有用的。
如果条带是正确的,在嵌套PCR反应中的条带应该是略微小一些。
基本PCR和嵌套PCR产物的迁移率的不同取决于cDNA结构中GSP1和嵌套引物的位置。
RACE产物的克隆和测序:
可以利用胶回收试剂盒来回收RACE产物,此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。
如果你选择使用其他的纯化方法,最后用Tricine-EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。
电泳5μl回收的样品来鉴定回收的质量。
将回收的PCR产物直接克隆到/A型的PCR克隆载体中。
另外还可以利用接头和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位点,将产物克隆到常规载体中.
对于5‘端的RACE产物,我们建议挑取至少8-10个不同的克隆以获得5‘端的最大可能性的序列。
(反转录并不总是进行到mRNA模板的5’末端,尤其是长模板。
另外,T4DNA聚合酶会移走5‘末端的0-20个碱基。
)
一旦鉴定了含有插入片断的克隆,应该获得多的序列信息。
理想的是,可以对整个开放读码框进行测序。
包括5‘和3‘的非翻译区。
全长cDNA的获得
通过部分或全部测序鉴定了RACE产物后,可以通过两种选择获得全长的cDNA。
通过PCR的方法获得全长cDNA:
扩增长的cDNA需要较长的延伸时间,但是如果延伸的时间过长,可以产生拖带,所以要慎重的设计引物。
根据从5‘和3‘RACE产物获得序列信息设计5’和3‘GSP引物。
这些引物应该来自cDNA的3’或者5‘的末端,应该是23-28nt长。
不应该在引物的末端加上限制性位点,这样会导致高背景。
在某些时候可以设计3’和5‘的嵌套引物。
但是还是应该先利用一对引物进行PCR反应。
进行如下的热循环:
94度30秒
25个循环94度5秒
72度2-15分钟
延伸的时间应该等于预期的cDNA长度加上2分钟。
例如:
预期得到6kb的条带,用6+2=8分钟的延伸时间。
注意:
如果没有条带或者条带弱,增加5个循环;或者优化PCR的条件。
在1.2%的琼脂糖凝胶上分析5μl的样品。
通常情况下,可以见到一条单一带,如果这样,利用胶来纯化全长的cDNA。
制备1.2%的TAEbuffer制备琼脂糖凝胶。
不使用TBEbuffer,TBE的胶很难制备全长的cDNA。
将剩下的45μl反应物点样,选用适当的marker。
利用长波紫外观察cDNA(≧300nm)切下全长的cDNA。
注意:
应该尽量减少紫外对cDNA的照射。
利用胶回收试剂盒回收cDNA。
此试剂盒适合回收2.5kb以下的RACE产物;对于长的片段,可以通过电洗脱获得好的结果。
如果你选择使用其他的纯化方法,最后用Tricine-EDTAbuffer30μl重新悬浮DNA样品。
将全长的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆载体中。
通过克隆产生全长的cDNA:
如果你已经获得了含有重叠部分的5‘和3’RACE产物,同时在cDNA的重叠部分含有一个酶切位点的话,通过克隆技术可以获得全长的cDNA。
利用酶切获得的3‘和5’扩增产物,并且利用T4DNA连接酶将它们连接起来。
利用接头和cDNA合成引物中的内切酶将最终的全长cDNA克隆到载体中。
在哺乳动物基因组中,NOT1和Srf1酶切非常稀少,大约106bp才出现一次,因此在绝大多数的cDNA中是不出现的。
Appendix:
cDNA接头和引物
接头在设计的时候可以使cDNA的扩增成功进行:
接头的5‘端在第一个循环中没有AP1引物的结合位点。
AP1的结合位点只有通过GSP的扩增之后才能够产生。
这些特点中的每一个都可帮助减少cDNA片段扩增过程中出现的非特异性扩增。
另外,它们允许从一个复杂的DNA片段的混合物中扩增出靶样品――所有的产物都有相同的末端结构,因为使用了单一的一套GSPs。
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