生化工程教案09Word文档下载推荐.docx

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2．掌握酶促反应和抑制反应的动力学；

3．了解酶的有关知识；

4．了解酶促反应的影响因素。

重点与难点

酶催化反应动力学

教学手段与方法

教学模式：

启发讲解与学生讨论相结合。

教学手段：

板书。

教学过程：

（包括授课思路、过程设计、讲解要点及各部分具体内容、时间分配等）

授课过程：

第五章酶与酶工程

Enzymeandenzymeengineering

第一节概述

酶是活细胞所产生的一种具有特殊催化功能的蛋白质。

酶参与生物体内的新陈代谢，没有酶就没有生命活动。

自古以来酶就被人类应用于日常生活，也用于治病（转氨酶——肝炎）。

酶不仅由活细胞所产生，而且从细胞分离后仍可继续发挥作用——酶制剂的生产。

酵母的无细胞抽提液，可使糖发酵为酒精。

酶工程是利用酶的特异性催化功能并通过工程化为人类生产有用产品及提供有益服务的技术。

酶工程是现代生物工程的重要组成部分，主要内容包括：

酶的生产、酶的固定化、酶的应用、酶反应器、酶反应动力学的研究。

第二节酶的分类与命名

一、酶的分类

按酶所催化的反应类型，国际生物化学联合会酶学委员会（Enzymecommission，EC）将酶分类6大类。

（一）氧化还原酶oxido-reductase

在生物获取能量过程中起着重要作用。

多以脱氢加氢的方式进行，脱氢为氧化，加氢为还原。

包括氧化酶（oxidase）和脱氢酶（dehydrogenase）

葡萄糖氧化酶：

葡萄糖+O2→葡萄糖酸

乙醇脱氢酶：

乙醇+NAD→乙醛+NADH2

（二）转移酶transferase

催化功能基团的转移反应。

谷丙转氨酶：

谷氨酸+丙酮酸→α-酮戊二酸+丙氨酸

如果转移的基团是高能基团，基团的转移就伴随能量的转移，催化这类反应的转移酶称为激酶。

己糖激酶：

葡萄糖+ATP→6-磷酸葡萄糖+ADP

（三）水解酶hydrolase

催化水解反应。

淀粉酶：

淀粉+H2O→葡萄糖

（四）裂解酶lyase

催化非水解性、非氧化性分解，分离出H2O、NH3、CO2及醛等小分子而留下双键，或者反过来催化底物双键的加成。

天冬氨酸→顺丁烯二酸+NH3

（五）异构酶isomerase

催化异构反应，包括旋光异构、顺反异构、分子内氧化还原以及分子内转移等。

葡萄糖异构酶：

葡萄糖→果糖

（六）合成酶synthetase

又称连接酶，催化合成反应，如蛋白质、脂肪等的合成，一般为吸能过程，通常有ATP等高能物质参加反应。

通式：

X+Y+ATP→X-Y+ADP+Pi

丙酮酸羧化酶：

丙酮酸+CO2+ATP→草酰乙酸+ADP+Pi

二、酶的命名

系统命名法、习惯命名法

均根据底物名称（底物之一为水可略去）和反应类型来命名，不过前者要求更为严格详细。

L-乳酸+NAD→丙酮酸+NADH2

系统命名：

L-乳酸：

NAD氧化还原酶，分类编号EC1.1.1.27

习惯命名：

乳酸脱氢酶

系统命名法还往往用4个数来标记每一种酶。

系统命名法中，每一种酶都有一个名称，不至于混淆不清，一般在国际杂志、文献及索引中采用，但名称繁琐，使用不便，故在工作中及相当多的文献中仍沿用习惯命名法。

第三节酶的化学本质

酶是具有特殊催化功能的一类蛋白质。

一、蛋白质的基本组成单位——α-氨基酸

从不同天然蛋白质完全水解分离得到的20种氨基酸都是α-氨基酸。

除甘氨酸外，氨基酸的α-碳原子是一个不对称碳原子，因此具有旋光性。

α-氨基酸均为无色结晶，都能溶于水。

氨基酸是典型的两性电解质，当溶液的pH等于pI时，溶液所带静电荷为零。

各种氨基酸都有其特定的等电点，在等电点时氨基酸溶解度最小，容易沉淀。

工业上利用这一性质，可以分离制取氨基酸。

二、蛋白质的化学结构

（一）肽键和多肽链

连接氨基酸之间的键—CO—NH—称为酰胺键，又称肽键，是蛋白质分子中氨基酸之间连接的最基本的共价键。

（二）二硫键

在蛋白质多肽链中，连接氨基酸之间的共价键，除了肽键之外还有二硫键（—S—S—），它是由2个半胱氨酸侧链上的巯基—SH脱氢相连而成的硫桥。

二硫键是肽链内和肽链间的主要桥键，对蛋白质空间构象稳定性起着重要作用。

二硫键越多，蛋白质结构越稳定。

皮肤、毛发的蛋白质中二硫键最多。

（三）蛋白质结构的测定

1.片段重叠法

几种常见酶的水解部位P104

2.肽段氨基酸顺序测定法

Edman化学降解法的基本原理。

蛋白质测序仪（proteinsequenator）

三、酶的组成

单纯酶：

由单纯蛋白质组成，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等

结合酶：

酶蛋白+辅助因子

辅助因子：

●金属离子：

活性中心组成；

酶与底物的桥梁；

稳定酶的空间构象；

参与电子传递

●辅酶coenzyme：

与蛋白质结合比较疏松，可透析出来

●辅基prostheticgroup：

与酶蛋白结合牢固，不能透析出来

第四节酶的催化作用

一、酶催化作用的特点

除具有一般催化剂的共性特点外，尚有其独自的特点。

（一）极高的催化效率

催化效率相对普通催化剂高106~1013倍。

比如：

过氧化氢分解反应，用Fe2+催化，效率为6×

10-4mol/（mol·

s），用过氧化氢酶催化，效率为6×

106mol/（mol·

s），比前者的催化效率高1010倍。

（二）高度的专一性specificity（选择性）

酶对它所作用的底物有严格的选择性，一种酶只能催化某一类，甚至某一种物质起化学变化。

1.绝对专一性absolutespecificity

一种酶只能催化一种底物。

如脲酶只能催化尿素水解。

2.相对专一性relativespecificity

专一性程度较低，能催化具有相同化学键或基团的底物

如酯酶催化酯键的水解。

3.立体化学专一性stereochemicalspecificity

对底物的构象有特殊要求，只能催化底物的一种立体化学异构体。

如L-乳酸脱氢酶只能催化L-乳酸氧化，对D-乳酸不起作用。

由于酶的专一性，其催化反应产物比较单一，副产物少，有利于产品分离；

也保证了生物体内众多化学反应有条不紊的进行。

（三）反应条件温和mildreactioncondition

酶在常温、常压、接近中性pH条件下发挥作用。

对工业生产来说，可减少能量消耗，减轻设备腐蚀，对设备材质及制造要求大大降低。

（四）复杂的调节机制complexregulationsystem

生物体内酶的调节错综复杂，调控方式包括抑制剂调节、反馈调节、酶原激活、激素控制等。

工业化过程需视具体反应情况加以调控，以期获得最佳的转化效果。

二、酶催化作用机制

（一）酶的催化功能

一种化学反应的发生，其反应物分子必先具备足够的能量，即超过该反应所需的能障或能阈（energybarrier），使分子激活称为活化分子（activatedmolecule），反应才能进行。

活化分子比一般分子所多含的能量，也就是分子进行反应所必须取得的最低限度的能量，称为活化能（activationenergy）。

使活化分子增多有2种途径：

向反应体系加入能量；

加入适当的催化剂，降低反应活化能。

酶催化作用的实质就在于它能降低化学反应的活化能，使反应在较低能量水平进行，从而加速化学反应。

P108表5-3.某些反应的活化能

关于酶如何降低反应活化能曾有不同的解释，目前较为公认的是中间配合物学说（interinediatetheory）。

这个学说认为，在酶催化反应中，底物先与酶结合成不稳定的中间配合物，然后再分解释放出酶与产物。

E+S→ES→P+E

对有2种底物参加的反应，则

E+S1→ES1

ES1+S2→P+E

酶催化反应分2步进行，每一步反应的活化能较低，因而总的活化能也较低。

由图5-3看出，酶催化反应的表观活化能E为

E=E1+E2-E-1

中间络合物学说已经获得可靠的实验证据。

例如：

过氧化物酶催化过氧化氢与另一还原型底物反应：

E+H2O2→E-H2O2

E-H2O2+AH2→E+A+2H2O

此过程中，可用光谱分析法证明中间配合物E-H2O2的存在。

（二）酶的催化活性中心

1.活性中心

4个Ag+就能使相对分子质量为48万的脲酶活性完全丧失，可见活性中心只能是集中在分子中的有限部分。

活性中心可能就是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基，或这些残基上的某些基团，也可能是辅酶或辅酶分子上的某一部分。

活性中心是直接将底物转化为产物的部位，通常包括2部分：

●与底物结合的部分——结合中心bindingcenter，决定酶的专一性

●促进底物发生化学变化的部分——催化中心catalyticcenter，决定酶催化反应的性质

有些酶的结合中心和催化中心是同一部位。

2.酶原激活zymogenactivation

一些酶在细胞内合成后并不表现催化活性，这种无活性状态酶称为酶原zymogen。

通过有限的水解等作用可使酶原转变成有活性的酶，这一过程称为酶原激活。

如胃蛋白酶原。

酶原激活是通过去掉分子中的部分肽段，引起酶分子空间结构的变化，从而形成或暴露出活性中心，转变成具有活性的酶。

酶原的生物学意义：

保护组织细胞不致因酶的作用而发生自身消化和破坏。

（三）酶催化的高效机制

1.邻近approximation效应和定向orientation效应

邻近效应：

底物浓集于活性中心，有效浓度增加，反应速度增加。

定向效应：

底物发生一定的取向，分子间反应变成类似分子内反应，加快反应速率。

2.共价催化covalentcatalysis

酶含有亲核基团，如羟基、巯基、咪唑基等，这些基团有剩余的电子对，易于底物中的缺电子的原子形成不稳定的共价键化合物，使底物活化，加速反应。

3.酸碱催化acid-basecatalysis

狭义：

即H+、OH-的催化，由于酶反应的最适pH一般接近中性，因此H+和OH-的催化在酶反应中的作用是有限的。

广义：

即质子供体和质子受体的催化。

由于酶蛋白中含有多种可以起广义酸碱催化作用的功能基团，故其作用更大。

上述3种催化机制中，通常第一种（邻近和定向）作用更大。

不过在许多酶催化反应中，常常不是单一机制起作用，而是各种因素配合。

（四）酶催化的专一性机制

1.锁钥假说lock-keytheory

认为：

酶的天然构象是刚性的。

酶与底物分子在结构上有严格的互补关系，如果存在微小的差别就不能锲入。

不能解释为何酶能催化可逆反应的底物和产物。

2.诱导契合假说induced-fithypothesis

酶的活性部位在结构上是柔性的，会受底物分子的诱导而发生构象变化，酶与底物从而互补契合，进行反应。

目前公认诱导契合假说比较符合实际。

第五节酶催化反应动力学

酶催化反应动力学是研究酶催化反应的速度及其影响因素的学科。

一、底物浓度对酶催化反应速度的影响

（一）酶催化反应速度的测定

图中曲线为反应进程曲线，不同时间的反应速度就是时间为不同值时曲线的斜率。

研究酶反应速率通常都以反应的初速度initialvelocity为准，酶反应的初速度越大，意味着酶的催化活力越高。

酶活力enzymeactivity，是指酶加速化学反应的能力，常以单位时间内转化底物的数量来度量。

酶活力单位有U和kat

1kat=6×

107U

酶的比活specificactivity是指单位质量mg酶制品所具有的酶活力数。

（二）米氏方程的推导

对酶反应速度与底物浓度关系曲线解释比较合理的是中间络合物学说，即

反应产物P的生成速度取决于中间络合物ES的分解速度，即

v=dcp/dt=k2cES

经一系列推导，得米氏方程

v=vmaxcS/（Km+cS）

式中vmax——酶反应的最大速度；

Km——酶的米氏常数。

米氏方程能很好的说明酶反应的动力学曲线。

P114图5-8

（三）米氏方程参数的确定

在米氏方程中，当v=vmax/2时Km=cS，即Km为反应速度是最大反应速度一半时的底物浓度。

线性化处理：

双倒数作图法

以1/v对1/cS作图可得一直线，斜率为Km/vmax，纵轴截距为1/vmax，据此便可求出Km/和vmax。

P116图5-9

（四）米氏方程的意义

1.定量的关联了反应速率v和底物浓度cS的关系。

2.提供了重要的动力学参数Km。

Km是酶的特征常数，Km越小，酶与底物的亲和力越大。

如一种酶能与多种底物作用，则Km值最小的底物称为该酶的最适底物或天然底物。

3.反映了酶反应速率与酶浓度间的关系。

当cS>

>

Km时，v=k2cE0具有线性关系，即反应速率与酶浓度成正比。

二、温度对酶催化反应速度的影响

温度升高，反应速率加快，但同时酶蛋白逐步变性，反应速率随之下降。

酶反应的最适温度是这2种过程平衡的结果。

转折点T称为酶反应的最适温度（多在30~60℃）。

三、pH值对酶催化反应速率的影响

pH值影响酶分子活性部位上有关基团的解离。

一般最适pH值在5~8.例外：

胃蛋白酶为1.5.

四、激活剂activator对酶催化反应速率的影响

凡能提高酶的活性的物质称为激活剂或活化剂。

激活剂可能是某些金属离子，也可能是一些无机阴离子或小分子有机化合物。

五、抑制剂inhibitor对酶催化反应速度的影响

抑制作用inhibition是酶催化与非酶催化之间的重要区别。

抑制作用在生物体内起到了调控代谢速率的作用。

抑制作用可以是不可逆的（共价键结合，不能透析、超滤除去），也可以是可逆的（非共价键结合，可恢复）。

可逆抑制可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。

（一）竞争性抑制competitiveinhibition

底物S和抑制剂I争夺共同的酶活性中心。

动力学公式的推导，仍用前述的稳态法，不同的是在竞争抑制的情况下，游离酶浓度

CE=CE0—CES—CEI

可见，表观米氏常数Km’增大了（1+CI/KI）倍，酶和底物的亲和力降低了，酶反应速率相应减慢。

如果底物浓度cS增大，可减轻或解除该类抑制作用。

同样可用双倒数作图法求出动力学参数。

竞争性抑制物往往在化学结构上与底物相似，因而能与底物相互竞争地在酶的同一活性部位结合而产生抑制作用。

（二）非竞争性抑制noncompetitiveinhibition

抑制物和酶的活性中心以外的基团结合，故没有竞争作用，但导致酶活性中心的构型发生改变，从而使反应速率减小。

可用类似方法进行动力学处理，结果如下图所示。

Vmax减小，Km不变。

非竞争性抑制物的结构与底物并不相像，这类抑制作用的强弱取决于抑制物的绝对浓度，因而不能用增大底物浓度的办法来消除此种抑制作用。

思考题、讨论题、作业

1、酶催化反应动力学与工业生产之间有何关系？

教学后记