第十五章 病毒病的分子生物学诊断Word下载.docx

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构建病毒载体；

制备核酸探针等。

3．病毒基因克隆方法：

由于病毒基因组DNA和RNA以及单链和双链之别，可采用不同的基因克隆方法。

DNA病毒基因可在限制性内切酶切割后直接进行克隆；

RNA病毒基因则必须先在试管内反转录成cDNA后再行克隆；

反转录病毒基因可从感染细胞中提取前病毒DNA，随后再行克隆。

总之，病毒基因的克隆包括以下几种类型：

（1）单链DNA病毒的基因克隆主要指细小病毒科成员。

这类病毒的基因组为单链线状DNA，两端因回文序列而形成发卡结构，这一结构是病毒基因组复制的引物。

因此在感染过程中，病毒基因组可在宿主细胞内形成双链形式的中间复制型DNA。

提取这种复制型DNA，用单链核酸酶去除两端的发卡结构，就可对该病毒全基因组进行克隆；

也可用适当的内切酶切割后，回收所需的片段进行克隆。

（2）双链DNA病毒的基因克隆双链DNA病毒的基因组间差别较大。

较小的双链DNA病毒，如SV40、乙型肝炎病毒等，基因组为环状，克隆时用只有单一切点的内切酶切割，然后与适当的载体连接，就可以建立全病毒基因组的无性繁殖系；

较大的DNA病毒，如痘病毒科和疱疹病毒科的成员，克隆它们的全基因组十分困难，必须先用适当的内切酶将基因组切成较小的片段，然后再建立各片段的无性繁殖系，即建立基因组文库。

或者根据研究目的，进行目的片段的克隆。

这类病毒DNA均为线状双链，在克隆2个末端片段时，必须对该基因片段末端进行修饰，如补平或加接头，然后再行连接克隆。

（3）RNA病毒的基因克隆对分节段的RNA病毒，如流感病毒、轮状病毒、呼肠孤病毒等基因组，可先分离特定的RNA片段，反转录成cDNA后，加G/C尾或A/T尾与适当的载体连接。

对不分节段的RNA病毒基因组，也可分段反转录成cDNA后，进行克隆。

（4）病毒基因组中某一特定基因片段的克隆如已了解这一病毒基因组的酶切图谱，则可选用适当的限制性内切酶切割病毒基因组，回收特定片段，重组到适当的质粒载体，进行克隆；

如已知需要克隆的基因片段的序列，便可设计并化学合成1对特异引物，用PCR法扩增这一片段，然后重组到适当的质粒载体进行克隆。

二、基因克隆与鉴定方法

虽然病毒种类和实验目的不同，基因克隆的方法也不尽相同，但任何一种病毒基因克隆方法均有3个主要步骤：

病毒基因组的提取；

与质粒载体的连接重组；

重组质粒的筛选、鉴定。

（一）病毒基因组的提取

基因组提取的基本原则是，先从感染组织或细胞、以及含病毒的分泌物和排泄物中提取病毒粒子，再除去病毒蛋白、提取病毒核酸。

在提取过程中，要注意避免核酸酶对病毒核酸的降解作用。

特别在提取RNA时，所用的试剂和用品均需要事先进行无Rnase处理或高压灭菌。

此外在提取较大分子量的病毒DNA时，要彻底去除病毒蛋白（通常使用蛋白酶K）和避免剧烈振荡（否则核酸链断裂）。

1．从纯化病毒子提取核酸：

一般方法如下。

（１）取适量纯化的病毒粒子；

（２）加入蛋白酶K至终浓度500g/ml、SDS至终浓度1%，37℃水浴30min；

（３）加入等体积酚/氯仿抽提1次，再用氯仿抽提1次；

（４）于水相中加1/10体积2.5mol/LKAC或5mol/LNaCl，再加2.5倍体积无水乙醇，置―20℃至少2h或―80℃（或液氮气相）15min；

（５）在4℃下，15000r/min离心15min，小心吸取上清；

（６）70%冷乙醇洗涤沉淀，真空抽干，或置37℃干燥，最后根据需要加适量无菌去离子水或TE缓冲液（10mmol/LTris-HCl，pH8.0，1mmol/LEDTA）溶解核酸沉淀，―20℃保存备用。

这样提取的核酸纯度较高，DNA可直接用于酶切和克隆，RNA可直接进行常规反转录合成cDNA，或者应用RT-PCR扩增所需基因片段。

2．病毒感染细胞总RNA的提取：

PCR不要求十分纯净的病毒核酸，可直接用聚乙二醇（PEG）浓缩的病毒提取核酸样品。

对不易纯化的病毒进行基因克隆时，可在病毒粒子装配之前，病毒核酸复制达高峰时，直接提取感染细胞的核酸，用PCR方法扩增所需的基因并克隆。

现以猪瘟病毒为例介绍。

（1）创造一个无RNA酶（RNase）的环境RNase无处不在，很难灭活，RNA在提取过程中极易被其污染而降解。

因此，为提取完整的RNA必须创造一个无RNase的环境。

须作到以下几点：

①必须采用灭菌的一次性塑料制品，不得重复使用。

若塑料制品无Rnase污染，不需预先进行Rnase灭活处理。

②非一次性玻璃和塑料用品须在使用前适当处理，以确保无Rnase。

玻璃器皿应于250℃干考4h，塑料制品应用0.05%焦碳酸二乙酯（DEPC）浸泡过夜，然后高压灭菌。

③所有溶液（Tris除外）均须加入0.05%的DEPC，室温处理过夜，然后高压灭菌，去除DEPC。

④整个操作过程应戴一次性手套。

（2）感染细胞总RNA的提取

①单层细胞在接种病毒48h后，倾弃培养液，用灭菌的PBS（0.01mol/L，pH7.4）将细胞单层洗2遍。

②按每108个细胞加8ml变性溶液于感染细胞单层上，轻微摇动，直至细胞裂解脱落，此时，溶液变粘稠。

变性溶液的成分为4mol/L异硫氰酸胍，25mol/L柠檬酸钠（pH7.0），0.5%十二烷基肌氨酸钠（sarcosyl），0.1mmol/L-巯基乙醇。

③用吸管将此裂解液转移至50ml锥形灭菌离心管中。

④加入1/10体积的2mol/LNaAc（pH4.0）于上述细胞裂解液中，颠倒并充分混匀。

⑤加等量水饱和酚:

氯仿:

异戊醇（50:

49:

1）混合物，颠倒混合，轻轻摇荡10s，冰浴15min。

⑥4℃下，8000r/min离心20min。

⑦小心吸取含RNA的上层水相至另一新的50ml离心管中。

⑧加等量异丙醇，置―20℃过夜，或液氮气相（或）15min。

⑨4℃下，8000r/min离心15min沉淀RNA，倾去上清。

⑩将RNA沉淀重悬于5ml变性液中，为加速溶解，可65℃短时加热。

11）重复⑧、⑨步。

12）用75%的冷乙醇洗RNA沉淀2遍。

13）RNA沉淀在真空抽干机中干燥15~20min，但不要完全干燥，以免难以溶解。

14）将RNA溶于1ml无Rnase的去离子水中，―20℃贮存。

如欲长期保存，可加NaAc（pH5.0）至终浓度0.2mol/L，而后加2.5倍体积的无水乙醇，置―70℃贮存。

（二）连接重组

即在试管中将病毒DNA（包括cDNA）与适当酶切的质粒载体DNA连接在一起，形成重组质粒，从而构建病毒DNA的无性繁殖系。

将病毒基因片段连接到质粒载体上时，可用以下几种连接方式：

1．粘端连接：

若DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。

同源粘性末端包括同一种内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补性粘性末端，后者连接成的DNA不能再被原切割内切酶识别，而不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。

同源粘性末端连接效率高，但也存在弊端，例如插入片段存在两个方向插入的可能性；

插入片段间可相互连接，导致载体中可能存在几个插入片段；

载体自身环化机率高，故应在连接前，将酶切完全的质粒载体DNA用碱性磷酸酶处理，使其5´

端去磷酸化以减少自身环化，降低假阳性重组子背景。

2．平端连接：

如重组对象不适合粘端连接，则可用平端连接进行重组。

通常的做法是用产生平端的内切酶切割载体。

如用产生粘端的内切酶切割载体，其产生的粘端若是5´

端突出的，需要用DNA聚合酶将粘端补平；

若是3´

端突出的，需要用单链核酸酶或T4DNA聚合酶（它有3´

→5´

外切酶活性）将突出的3´

端削平。

病毒DNA也需要补平或削平，将其修饰成平端。

然后再用连接酶将它们连接在一起。

平端连接的特点是可以恢复一个原始的，甚至产生一个新的酶切位点。

位点的恢复或创建是十分有用的，它提供了一条简捷的重组子筛选鉴定途径，并可方便地使插入片段重新从重组子中回收出来。

平端连接存在的弊端是它的连接效率比粘端连接低的多，连接时需要高浓度的连接酶和高浓度的DNA末端（大于1mol），而且插入方向不确定。

3．粘端和平端结合连接：

也可以一端为粘端，另一端为平端连接。

例如要把EcoRI/Hae

的酶切基因克隆到pBR322上时，首先用Hind

切开质粒DNA，用大肠杆菌DNA多聚酶

的Klenow片段，修补Hind

消化后的5´

端突出部分，使之成为平端，再用EcoRI消化，纯化后所得载体DNA的一端为平端，另一端为EcoRI粘端。

这样就可以与EcoRI/Hae

的酶切基因进行连接。

连接中，外源DNA片段的插入只有一种可能性，有助于病毒DNA与载体的定向克隆。

4．将病毒DNA修饰后连接：

先将病毒DNA修饰成平端后，可用酶促法在两端加上适当的接头（linker）或适配子（adaptor），将其修饰成粘端，然后再与相同粘端的载体连接。

这种连接虽然有助于病毒DNA片段的回收，但是修饰过程复杂，效率也低，转化细菌后非重组背景高，且可能有多拷贝插入及双向插入等。

（三）载体的选择与处理

常使用的质粒载体是pBR322及其衍生质粒和pUC系列质粒（pUC18/pUC19）等，均为松弛型质粒，拷贝数可超过1000，因此病毒基因片段插入这类质粒以后，可以大量制备。

质粒pBR322含有氨苄青霉素（Ampr）和四环素（Tetr）抗性基因，外源基因可克隆到四环素基因中的单一酶切位点，使Tetr基因灭活，转化细菌仅抗氨苄青霉素而对四环素敏感；

外源基因也可克隆到氨苄青霉素基因中的单一酶切位点，使Ampr基因灭活，转化细菌仅抗四环素而对氨苄青霉素敏感。

pUC18/pUC19克隆质粒含有一个多克隆位点的LacZ基因，外源DNA片段可插入该基因中的任何酶切点，将阻碍半乳糖苷酶氨基端片段的表达。

因此可用组织化学筛选法挑选重组质粒。

pUC18与pUC19的不同仅限于多克隆位点的方向不同，并无其他方面的不同。

上述细菌质粒主要用于较小的DNA片段（10kb）的常规克隆，如果要克隆10kb以上的病毒DNA片段，通常使用粘性质粒和噬菌体载体。

克隆成功与否，除与连接方式以及载体选择有关外，载体的处理也是一个重要环节。

（四）DNA片段的体外连接

DNA片段的体外连接本质是一个酶促的生化反应过程，促进该反应的酶称为DNA连接酶（DNAligase），主要有两种：

T4噬菌体DNA连接酶（简称T4DNA连接酶）和大肠杆菌DNA连接酶，它们将两个独立的DNA片段形成磷酸二酯链共价连接，但以T4DNA连接酶的应用最为广泛。

由于大肠杆菌DNA连接酶对DNA末端要求严格（同源粘端），而且几乎不能催化平端DNA分子间的连接，所以不常使用。

连接反应的操作步骤如下：

（1）取100～200ngCIP（牛小肠碱性磷酸酶）去磷酸的线性载体DNA，加入2倍摩尔数的外源DNA片段。

（2）加入2l10倍T4DNA连接酶缓冲液。

（3）加入ATP至终浓度0.5～1mmol/L（平端连接时为0.5mol/L）。

（4）加入去离子水，补足19l。

（5）加入1lT4DNA连接酶。

（6）16℃连接4小时，或4℃连接过夜。

（7）75℃灭活连接酶，终止反应，取2l电泳鉴定是否已经连接。

（8）取3～5l转化感受态菌。

（五）转化大肠杆菌

体外连接的重组子，只有导入适宜的大肠杆菌受体后，才能随着大肠杆菌的增殖而大量复制和扩增，从中提取大量的克隆基因。

质粒DNA或以其他载体构建的重组子导入细菌的过程，称为转化。

转化时，受体菌必须经过特殊处理，诱导细菌产生一种短暂的“感受态”，这样才能摄入各种不同来源的DNA。

这种处理过的受体菌，即为“感受态菌”。

电穿孔法是另一种有效的转化细菌的途径，适用于各种细菌，转化率比化学法制备的感受态菌高10～20倍，可达109～1010菌落/g质粒DNA。

其原理是以高电压（数千伏）在很短时间（微秒时间）内脉冲电击菌细胞，使细胞膜产生许多小孔，质粒DNA通过这些小孔进入菌体而转化。

（六）重组子的筛选与鉴定

基因克隆过程中，由于反应不完全，常常发生自身环化；

载体酶切可能不完全，以及出现好几种连接情况等等。

在建立病毒基因文库时，载体可与不同DNA片段连接而形成不同的重组子。

故在转化以后，从转化细菌菌落中挑选试验者所设计和期望的重组子是病毒基因克隆中最后一道重要工序。

挑选后，通过细菌培养以扩增所需重组子，回收所需基因片段的大量拷贝，以便进一步研究该基因的结构、功能或表达该基因产物。

重组子的筛选、鉴定均采用以下几种基本方法：

1．快速法提取质粒鉴定大小：

用牙签从平板上直接挑取菌落，裂解并进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外灯下挑选带有比载体质粒大的重组子的菌落，再做培养，提取重组子DNA进行酶切分析，作重组子的最初筛选。

2．-半乳糖苷酶筛选系统（互补）：

现在使用的许多载体带有一个大肠杆菌DNA片段，其中含有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，这个编码序列中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读码框架。

含有此种载体的细菌，可产生-半乳糖苷酶，形成蓝色菌落。

然而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致产生无互补能力的氨基端片段。

因此，带重组质粒的细菌形成白色菌落。

据此可挑选带重组质粒的菌落，但并非所有白色菌落均带有重组质粒，必须通过小量制备质粒DNA进行限制性酶切分析，才能确定带有重组质粒的菌落。

3．插入灭活筛选：

如pBR322载体含有四环素（Tetr）和氨苄青霉素（Ampr）二个抗性基因，外源基因插入灭活Tetr基因。

将连接物转化细菌的菌落对应接种分别含有氨苄青霉素和四环素的两种平板。

在四环素平板上生长的菌落不可能有外源DNA插入；

在四环素平板上不生长而在氨苄青霉素平板上生长的菌落含有带灭活Tetr基因的质粒，这些质粒可能带有外源DNA序列，最后小量提取这些质粒DNA进行酶切鉴定。

4．菌落原位杂交筛选：

以放射性或非放射性方法标记需要克隆的病毒DNA片段，以此作为基因探针，对连接转化的菌落进行原位杂交，可从数十万个细菌菌落中找出带有所需要的重组子的菌落，是从基因文库中挑选目的重组子的首选方法。

5．小量提取质粒DNA进行酶切分析：

由于体外DNA重组是按设计进行的，所以在用上述方法初步鉴定重组子以后，可以小量提取质粒，按设计要求，用酶切分析方法对重组子的正确性加以验证。

第三节　病毒基因探针的制备

选择病毒基因序列作为探针时，首先作为探针的核酸片段必须含有病毒独特的核酸序列，其次探针来源于重组质粒中已克隆的病毒DNA片段，这样才能保证探针的高度特异性和易于大量制备。

一、病毒基因探针的种类

根据来源和性质，病毒基因探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和化学合成的寡核苷酸探针等几类。

1.基因组DNA探针：

对于双链DNA病毒，可用限制性内切酶切割其基因组DNA，克隆其中一段最具该病毒特点的基因序列作为探针材料。

对于单链DNA病毒，由于其基因组不能被限制性内切酶切割，制备这类病毒探针时，先用DNA聚合酶制备双链DNA，或者提取感染细胞中的复制型双链DNA，用适当内切酶切割后，克隆特异片段制备探针。

2.cDNA探针：

制备单链或双链RNA病毒的探针时，先对病毒RNA进行反转录，合成该病毒的cDNA，然后克隆特异cDNA片段作为探针材料。

3.RNA探针：

应用RNA探针进行分子杂交是较为理想的。

因为：

RNA/RNA或RNA/DNA杂交比DNA/DNA杂交体更稳定，杂交反应可在更严格的条件下进行，因而杂交的特异性更高，结果更可靠；

RNA探针为单链，不存在互补双链的竞争结合，其与待测核酸的杂交效率更高；

杂交后，可用Rnase将未杂交的探针RNA消化掉，从而使本底降低。

RNA探针大多是通过基因组DNA或cDNA克隆经体外转录而获得的。

4.寡核苷酸探针：

根据病毒的特异序列，于DNA合成仪上化学合成一段寡核苷酸，即可作为探针使用。

其优点是容易制备，可根据需要随意合成任何序列，在合成时可加入带有标记物的某一种dNTP，因此片段合成后勿需另外标记，纯化后即可直接进行杂交。

这类探针较短，长度一般不超过50nt，所以它带的标记物相对较少，其灵敏度也较低。

二、病毒基因探针的标记

因标记物不同，基因探针的标记方法可分为放射性标记法和非放射性标记法。

根据标记的部位，放射性标记可分为核酸片段内标记和末端标记。

1.DNA探针放射性标记法：

诊断通常使用片段内标记法制备的探针，末端标记法制备的探针常用作S1核酸酶作图和DNA测序。

片段内标记法包括缺口翻译标记和随机引物法。

（1）缺口翻译其原理是用微量的Dnase

在双链DNA上随机形成单链切口，然后利用大肠杆菌DNA聚合酶

的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新合成的DNA链中去。

大肠杆菌DNA聚合酶

具有两种活性：

在缺口处从DNA5´

向3´

末端水解单链DNA；

以一条DNA链为模板，从DNA5´

末端合成新的单链DNA片段。

如果在DNA聚合酶处理特探针DNA片段的同时，加入32P标记的dAT或dCTP和其他3种非标记碱基，32P标记的碱基则可以掺入到新合成的DNA链中去，产生32P标记的放射性DNA片段。

（2）随机引物法（randompriming）在待标记的探针DNA变性后加入随机引物（常用化学合成的六核苷酸寡聚物），在随机引物的引导下和大肠杆菌DNA聚合酶

大片段的催化下合成探针链。

在合成过程中，加入放射性或非放射性标记的dNTP进行标记。

2.DNA探针非放射性标记法：

该法原理同上述随机引物法，只是将同位素标记的dNTP换成非同位素如地高辛标记的dUTP。

用标记的探针与被检DNA或RNA杂交。

加入碱性磷酸酶交联的抗地高辛抗体与杂交的探针结合，最后加入显色剂5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐（BCIP）和硝基篮四氮唑（NBT）直接在硝酸纤维素膜上显色。

3．RNA探针标记法：

RNA探针的制备与标记一般通过体外转录进行。

即将探针DNA片段克隆到噬菌体启动子驱动的转录表达载体中，通过启动子特异的RNA聚合酶的催化作用，在试管中以探针DNA的一条链为模板，转录RNA链，在转录过程中，如加入放射性或非放射性标记的Rntp（通常用标记的rCTP、rGTP或rUTP），合成的RNA即可作为探针。

转录载体中所使用的启动子是噬菌体的特异启动子，如SP6，T7，T3等，每一种启动子被各自的RNA聚合酶识别。

所以应用不同的启动子就可构建不同类型的转录载体。

第四节　核酸杂交检测技术

核酸杂交技术正逐渐用于病毒病的特异、敏感和快速诊断，用已知序列的病毒探针与待检样品中的病毒核酸进行杂交，通过特定方法检测，如有杂交信号，则说明样品中存在病毒核酸，进而证明病毒感染大的存在。

杂交的基本原理是碱基互补的二条单链核酸退火形成双链。

待测的病毒核酸可以从病料中提取，也可以从纯化的病毒粒子提取。

提取后可在膜上与探针杂交（固相杂交），或直接在试管的杂交液中杂交（液相杂交），此外，也可直接在组织切片或细胞涂片上对细胞中的病毒核酸进行杂交（原位杂交）。

一、核酸打点杂交

核酸打点杂交是最常用的一种杂交检测方法，是作为诊断目的的首选方法。

它是将一定量的病毒核酸（DNA或RNA）打点在固相支持膜（通常是硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，然后与放射性或非放射性标记的（DNA或RNA）探针进行杂交，杂交后通过放射自显影（检测放射性探针）或显色反应（检测非放射性探针）检测杂交信号。

阳性杂交信号表明病毒核酸的存在，检测出病毒核酸就充分说明发生了病毒感染。

二、核酸酶保护分析法

该法是一种新的RNA检测方法，它基于一种液相杂交方法，即被检测RNA链与均一分子的放射性标记的单链探针在试管中进行杂交，然后用适当的单链核酸酶（S1核酸酶，RNA酶A和T1）水解掉未杂交的单链核酸，电泳分离后，通过放射自显影检测未被水解的双链杂交体。

1．RNA酶保护分析法（RNaseprotectionassay，RPA）：

本方法所采用的探针是单链RNA，它比DNA/RNA杂交体稳定得多。

杂交后加入适量RNA酶A和T1，它们专一性地水解未形成杂交体的单链RNA，而探针与被检RNA杂交后形成的双链RNA则被保护，电泳分离后，通过放射自显影显示杂交信号。

此法甚为敏感，可检测每个细胞中1~5个RNA拷贝。

2．S1核酸酶保护分析法：

此法类似于RPA，只是所用的探针是单链DNA（一般不用双链DNA探针），所用的酶是S1核酸酶，它能降解单链DNA或RNA，而RNA/DNA杂交体则被保护。

三、核酸原位杂交

所谓原位杂交，就是保持组织与细胞形态的完整性，用核酸探针直接检测细胞内的靶核酸序列。

它可以检测和精确定位胞浆内或细胞器上，胞核内或染色体上的各种靶核酸序列。

该方法不需要从组织细胞中提取核酸，对细胞中含量极低的靶序列有较高的敏感性。

原位杂交能检测细胞中病毒核酸的复制与表达以及病毒的传播，并对细胞中的病毒核酸进行定位；

它能鉴定感染细胞中病毒基因的整合以及染色体上得整合位点。

应用该方法，还能检测持续感染个体中何种组织含有病毒。

第五节　PCR扩增技术

PCR的全称是聚合酶链式反应（polymerasechainreaction），它是由KaryMullis于1987年发明的。

1976年人们发现了一种特殊的DNA聚合酶，它可以耐受94℃高温而不失活。

1985年Saiki等人发现用聚合酶Klenow大片段催化25次DNA聚合反应（由于此酶不耐高温，所以每次反应需加入新的Kleno