微生物检验复习提纲文档格式.docx

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3、消毒（高压蒸汽灭菌锅使用）

灭菌方法：

1、加水于灭菌器内到规定的水平面。

2、需灭菌的物品（分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基），棉塞、硅胶泡沫塞等用防潮纸包好（防止锅内水汽把棉塞淋湿），放入灭菌锅内的套筒中。

摆放要疏松，不可太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果。

3、将灭菌锅盖旋转，使锅盖向下紧压锅体，切勿漏气。

4、设定灭菌温度和时间：

121摄氏度，20分钟；

5、打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气，当温度到达100摄氏度左右，关闭放气阀。

6、关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压力和温度都上升，直至压力表指针达到所需压力时，温度达到121摄氏度，灭菌开始计时，通过调节热源，维持此压力到所需时间。

7、灭菌完毕，待压力自然降至0时，打开放气阀，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。

8、打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。

9、灭菌锅用完后，将锅内剩余的水倒掉，以免日久产生水垢。

二、其他灭菌和消毒方法P104

消毒：

是用物理、化学或生物的方法杀死病原微生物的过程。

灭菌：

是指杀灭物体中或物体上的所有微生物（包括病原微生物和非病原微生物）的繁殖体和芽孢的过程。

灭菌的方法分为物理灭菌法和化学灭菌法。

物理方法：

（1）干热灭菌法①灼烧灭菌法：

利用火焰直接把微生物烧死。

此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品或实验动物尸体等的灭菌。

②干热空气灭菌法：

把待灭菌的物品均匀的放入烘箱中，150~170℃，恒温1~2小时即可。

此法适用于玻璃器皿、金属用具等的消毒。

（2）湿热灭菌法在相同的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好。

这是因为，细胞内蛋白质含水量高，容易变性；

高温水蒸气对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。

①巴氏消毒法：

既保持食物的营养和风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。

主要有两种方法：

第一种是在63℃下，30分钟消毒；

第二种是在75℃下保持15秒。

②煮沸消毒法：

直接将要消毒的物品放入清水中，煮沸15分钟，即可杀死细菌的全部营养细胞和部分芽孢。

③间歇灭菌法：

将待灭菌的物品加热至80~100℃，15~30分钟，杀死其中的营养体。

然后冷却，放入37℃恒温箱中过夜，然残留的芽孢萌发成营养体。

第2天再重复以上步骤，如此进行3次左右，就可以达到灭菌的目的。

④高压蒸汽灭菌法：

实验室最常用的一种方法。

是把待灭菌的物品放在一个可密闭的高压蒸汽灭菌锅内进行，以大量蒸汽使其中压力升高。

在蒸汽压力达到103.4KPA时，水蒸气的温度可达到121℃，微生物（包括芽孢）在15~20分钟内便会被杀死，而达到灭菌的目的。

化学方法：

一般化学药剂无法杀死所有的微生物，只能杀死其中的病原微生物，只能其消毒剂的作用。

能迅速杀灭病原微生物的药物，称为消毒剂；

能抑制或阻止微生物生长繁殖的药物，称为防腐剂。

常见的有酸、碱、盐、氧化剂、其他有机物等。

三、无菌操作技术

培养基经过高压蒸汽灭菌后，用经过灭菌的工具，在无菌条件下，移接含菌材料于培养基上的过程。

斜面接种时的无菌操作

（1）接种灭菌

（2）开启棉塞（3）管口灭菌（4）挑起菌苔（5）接种（6）塞好棉塞注意：

无菌操作注意事项！

！

四、食品中菌落总数的测定（GB4789.2-2010）

是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中形成的细菌菌落总数。

以CFU/g（mL）来表示。

操作步骤：

（一） 

取样、稀释和培养

1、 

以无菌操作取检样25g（mL），放于225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振荡或研磨制成1:

10的均匀稀释液。

固体和半固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理1～2min，制成1:

液体样品以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:

10的样品匀液。

2、用1mL灭菌吸管吸取1:

10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管内（注意吸管或吸管尖端不要触及稀释液面），振摇试管,混合均匀，制成1:

100的稀释液。

3 

、另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL吸管。

4、根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。

同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。

5 

、稀释液移入平皿后，将冷却至46℃琼脂培养基注入平皿约15～20ml，并转动平皿，混合均匀。

6、 

待琼脂凝固后，翻转平板，置36±

1℃温箱内培养48±

2h。

7、培养结束后，进行菌落计数，得出实验报告。

计数规则：

选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。

低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。

每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；

若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

结果与报告：

若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。

若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式

（1）计算:

式中：

N——样品中菌落数

C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

菌落数小于100CFU时，按"

四舍五入"

原则修约，以整数报告。

菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用"

原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；

也可用10的指数形式来表示，按"

原则修约后，采用两位有效数字。

若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

五、食品中大肠菌群的测定（GB4789.3-2010）

大肠菌群指在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。

第一法大肠菌群MPN计数法

7.1样品的稀释7.1.1固体和半固体样品:

称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。

7.1.2液体样品:

以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。

7.1.3样品匀液的pH应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节。

7.1.4用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面）,振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。

7.1.5根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。

每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。

从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。

7.2初发酵试验每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液）,每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤,每管接种1mL（如接种量超过1mL,则用双料LST肉汤）,36℃±

1℃培养24h±

2h,观察倒管内是否有气泡产生,24h±

2h产气者进行复发酵试验（证实试验）,如未产气则继续培养至48h±

2h,产气者进行复发酵试验。

未产气者为大肠菌群阴性。

7.3复发酵试验（证实试验）用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中,36℃±

1℃培养48h±

2h,观察产气情况。

产气者,计为大肠菌群阳性管。

7.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告按7.3确证的大肠菌群BGLB阳性管数,检索MPN表（见附录B）,报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。

第二法大肠菌群平板计数法 

7检验程序 

大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。

8操作步骤

8.1样品的稀释

按6.1进行。

8.2平板计数

8.2.1选取2个～3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL。

同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

8.2.2及时将15mL～20mL冷至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。

小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆盖平板表层。

翻转平板，置于36℃±

1℃培养18h～24h。

8.3平板菌落数的选择

选取菌落数在15CFU～150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。

典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。

8.4证实试验

从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±

1℃培养24h～48h，观察产气情况。

凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。

8.5大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。

例：

10-4样品稀释液1mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：

100×

6/10×

104/g（mL）=6.0×

105CFU/g（mL）。

六、补充

1、食品相关法律法规：

食品安全法：

2015年10月1日正式实施健康证有效期一年

2、实验中操作问题讨论：

1.培养基灭菌后，需要冷却到45℃左右时，才能用来倒平板。

你用什么办法来估计培养基的温度？

答：

可以将培养基加热后置于46摄氏度恒温水浴锅中保温，也可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？

平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？

为什么？

空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。