Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白Protocol mRNA的分离纯化Word格式.docx

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1000）

5.吹打均匀，冰上放置30-40min，中间每10分钟Vortex一次；

6.4℃预冷离心：

10000rpm×

10min；

7.收集上清，转移至已预冷新EP管，即为总蛋白。

【为了浓缩蛋白，加RIPA的量改为200ul或者更低，可稍微延长冰上裂解时间，而RIPA

（1）＋PMSF（1：

100）＋Cocktail（1：

1000）的比例不变】

核，浆蛋白抽提Protocol

一.收核-浆蛋白

收浆蛋白

7的细胞），离心收集细胞（1100rpm×

5min×

10）1.；

细胞计数（约1.5用4℃预冷的PBS重悬，转至1.5mL2.的EP管中，离心（4000rpm×

5min，4℃）；

7cell，重悬，4℃放置10min，3.离心（加入ABuffer1mL/1×

102500rpm去上清，×

3min，4℃）；

7cell4.，重悬，4℃放置3min，离心加入A'

Buffer250uL/1.5×

10（5000rpm去上清，×

1min，4℃），吸取上清（上清是浆蛋白）；

收核蛋白

再用A'

Buffer500uL/1.5×

107cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×

5.

，把上清完全吸干净；

，吸走上清，12000rpm×

30sec1min，4℃）6.℃放置40min（每RAPI）50uL，重悬（振荡），4剩余沉淀中加入B'

Buffer（或者振荡一次）；

隔10min7.，取上清即为核蛋白，－80℃保存。

℃）离心（12000×

10min，4

BufferA的配制：

终浓度

母液

配40Ml（10ml）溶液所需的量

HepesPH7.9

10mM

1M

400uL（100ul）

MgCl2

1.5mM

2M

30uL（7.5ul）

KCl

250mM

1.6mL（400ul）

DTT

0.5mM

0.1M

200uL（50ul）

!

O补足至要求体积ddH剩余体积用2

的配制：

BufferA'

（2ml）=1960ulBufferA+40uL10%NP-40+20uL10mg/mLPMSF+1uLAprotinin

（1ml）=980ulBufferA+20uL10%NP-40+10uL10mg/mLPMSF+1uLAprotinin

（Aprotinin可以用cocktail代替,而且只要核蛋白的时候可以不加）

BufferB的配制：

配40mL（10ml）溶液所需的量

20mM

800uL（200uL）

甘油

25%

％50

20mL（5mL）

NaCl

0.42M

3M

5.6mL（1.4mL）

EDTA

0.2mM

0.5M

16uL（4uL）

200uL（50uL）

NP-40

0.2%

10％

800uL（200uL）

补足至要求体积ddHO剩余体积用2

'

BufferB）

代替cockltail可以用=1mLBufferB+10uL10mg/mLPMSF+0.5uLAprotinin（'

BufferB

核基质蛋白抽提Protocol

7的细胞），离心（1100rpm×

5min细胞计数（约1×

10）收集细胞；

、1

2、用4℃预冷的PBS重悬，将细胞移至1.5mlEP管中，1×

PBS洗一遍；

7的细胞，裂解细胞，至冰上15-30min；

300ulRIPA/1×

10加3、

RIPA＋PMSF（1：

4、4℃预冷离心：

13000rpm×

10-15min；

5、将离心后的上清转移至新的已4℃预冷的1.5mlEP管，冰上备用（总蛋白）；

6、用１×

PBS洗管底的pellet×

2遍；

7、加入Urea-Lysisbuffer10-15ul裂解pellets，vortex10min；

8、4℃预冷离心：

用BufferA90ul稀释，此为核基质蛋白。

RIPA（PH8.0）：

150mMNaCL

1%NP-40

0.5%DOC

0.1%SDS

50mMTris

Urea-Lysisbuffer（PH8.0）：

100mMNaH2PO4

10mMTris-HCL

300mMNaCL

8Murea

BufferA：

1%TritonX-100

cytoplasmiccellfractionswerepreparedbyincubatingthecellsinicecold

Iso-Hibuffer

140mMNaCl

25mMTris[pH7.4]

1.5mMMgCl2）

0.5%NonidetP-40

for5minandthensubjectingthemtolow-speedcentrifugationtocollectthenuclei.Nucleiwere

incubatedin

high-saltextractionbuffer

20mMHEPES（pH7.9）

25%（v/v）glycerol

0.5MNaCl

1.5mMMgCl2

0.2mMEDTA

0.5mMphenylmethylsulfonylfluoride（PMSF）

0.5mMDTT;

for1hat4C.TheDNA-particulatefractionwaspelletedbymicrocentrifugation（15,000rpm）,

washedonceinhigh-saltbuffer,solubilizedinradioimmunoprecipitationassaybuffer（RIPA）,and

sonicatedtosheertheDNA.Equalamountsofallfractionswereprecipitatedwithtrichloroacetic

sulfate

dodecylsodiumaonseparatedandbuffer,sampleproteininresuspendedacid,

（SDS）–10%polyacrylamidegel.

AccuratetranscriptioninitiationbyRNApolymeraseIIinasolubleextractfrom

isolated（nuclearextraction）

bufferA:

10mMHEPES（pH7.9at4C）

10mMKC1

bufferB

0.3MHEPES（pH7.9）

1.4MKC1

0.03MMgCl2;

bufferC

0.42MNaCl

bufferD

20%（v/v）glycerol,

0.1MKCl,

0.5mMPMSF

0.5mMDTT

DTTandPMSFwereaddedfreshtothebuffersjustbeforeuse.

1，Pelletedcellswerethensuspendedinfivevolumesof4Cphosphatebufferedsalineand

collectedbycentrifugationasdetailedabove;

subsequentstepswereperformedat4°

C.

2，ThecellsweresuspendedinfivepackedcellpelletvolumesofbufferAandallowedtostand

for10min.

3，Thecellswerecollectedbycentrifugationasbeforeandsuspendedintwopackedcellpellet

volumes（volumepriortotheinitialwashwithbufferA）ofbufferAandlysedby10strokesofa

KontesallglassDouncehomogenizer（Btypepestle）.

Thehomogenatewascheckedmicroscopicallyforcelllysisandcentrifugedfor10minat2000

rpminaSorvallHG4Lrotortopelletnuclei.Thepelletobtainedfromthelowspeed

centrifugationofthehomogenatewassubjectedtoasecondcentrifugationfor20minat25,000

ga（SorvallSS34rotor）,toremoveresidualcytoplasmicmaterialandthispelletwasdesignated

ascrudenuclei.Thesecrudenucleiwereresuspendedin3mlofbufferCper109cellswitha

KontesallglassDouncehomogenizer（10strokeswithatypeBpestle）.Theresultingsuspension

wasstirredgentlywithamagneticstirringbarfor30minandthencentrifugedfor30minat

25,000g（SorvalSS34rotor）.Theresultingclearsupernatantwasdialyzedagainst50volumesof

bufferDforfivehours.Thedialysatewascentrifugedat25,000g（SorvallSS34rotor）for20min

andtheresultingprecipitatediscarded.Thesupernatant,designatedthenuclearextract,was

frozenasaliquotsinliquidnitrogenandstoredat-80°

.Theproteinconcentrationwasusually6

to8mgpermland15to20mgofproteinwereobtainedfrom109cells.

mRNA的分离纯化【实验原理】分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。

真核生物的所有蛋白真核生物的mRNA的分离纯化是克隆基因、提高的翻译产物，因此，高质量mRNA质归根到底都是mRNA1x10-5gRNAcDNA文库构建效率的决定性因素。

哺乳动物平均每个细胞含有约，理论上认为每克细胞可分离出5～10mgRNA。

其中rRNA为75％～85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。

真核生物mRNA有特征性的结构，即具有5'

端帽子结构（m7G）和3'

端的poly（A）尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3'

端存在20~300个腺苷酸组成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA3'

末端含有多poly（A）尾巴结构特性设计的。

当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo（dT））纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo（dT）纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo（dT）纤维素柱，即可得到较纯的mRNA。

目前常用的mRNA的纯化方法有：

（1）寡聚（dT）－纤维素柱层析法，即分离mRNA的标准方法；

（2）寡聚（dT）－纤维素液相离心法，即用寡聚（dT）－纤维素直接加入到总的

RNA溶液中并使mRNA与寡聚（dT）－纤维素结合，离心收集寡聚（dT）－纤维素／mRNA复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去寡聚（dT）－纤维素；

）－磁性球珠法等。

dT）其它一些方法：

如寡聚（3（

本实验应用方法

（1）进行mRNA的分离纯化。

【试剂与器材】

（一）试剂

1．0.1mol/LNaOH，每组200mL

2．寡聚Oligo（dT）-纤维素

3．加样/洗涤缓冲液1：

0.5mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl（pH7.6），每组250mL

或0.5mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl（pH7.6）,1mmol/LEDTA（pH8.0）,0.1%SDS。

4．洗涤缓冲液2：

0.1mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl（pH7.6），每组250mL或10mmol/LTris-HCl（pH7.6）,1mmol/LEDTA（pH8.0）,0.05%SDS。

配制时可先配制Tris-HCl（pH7.6）、NaCl、EDTA（pH8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SDS至终浓度。

5．5mol/LNaCl，每组10mL

6．3mol/LNaAcpH5.2，每组10mL

7．无RNase双蒸水（DEPC水），每组100mL

8．70%乙醇，每组10mL

注意：

溶液5，6的配制都应该加0.1%DEPC处理过夜，溶液1，3，4，8则用经0.1%DEPC处理过的无RNase双蒸水配制，Tris应选用无RNase的级别。

溶液配制后，最好能够按一次实验所需的分量分装成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次实验只用一份，避免多次操作造成对溶液的污染。

（二）器材

1．恒温水浴箱

2．冷冻高速离心机

3．紫外分光光度计

4．巴斯德吸管

5．玻璃棉

6．5ml一次性注射器

【操作方法】

（一）oligo（dT）纤维素的预处理

1．用0.1mol/LNaOH悬浮0.5-1.0goligo（dT）纤维素。

2．将悬浮液装入填有经DEPC水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0mL，用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo（dT）纤维素。

3．用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo（dT）纤维素，直到流出液的pH值小于8.0。

4．将处理好的oligo（dT）纤维素从巴斯德吸管倒出，用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮，浓度约为0.1g/mL，保存在4℃待用。

（二）总RNA浓度的调整

1．把实验一所提的总RNA转到适合的离心管中，如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL，则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL，总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。

把RNA溶液置于65℃水浴加热5分钟，然后迅速插在冰上冷却。

2．加入1/10体积5mol/LNaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5mol/L。

（三）mRNA的分离

1．mRNA与Oligo（dT）-纤维素结合：

用移液器重新悬浮oligo（dT）-纤维素，按下表取适量的oligo（dT）-纤维素到RNA样品中，盖上盖子，颠倒数次将oligo（dT）-纤维素与RNA混匀。

于37℃水浴保温并温和摇荡15分钟。

总RNA寡聚Oligo（dT）-纤维素洗涤缓冲液1，2洗脱体积（mL）（mL）（mg）（mL）

1.0<

0.21.00.2

1.50.2-0.50.51.5

3.00.5-1.01.03.0

5.0

1.0-2.05.0

2.0

的一次性注射器，取适量经过高温灭菌的玻璃棉塞紧前端，并把它2．个5ml转移：

取1悬浮液转移到注射器，推进塞子纤维素/RNAoligo（dT）-RNase固定在无的支架上，再把的离心管中（保留至确定获得足够RNase直至底部，把含有未结合上的RNA液体排到无的mRNA）。

，温和振荡，充分重新悬浮洗涤：

根据上表直接用注射器慢慢吸取适量的洗涤缓冲液13．的离心管收集洗出液。

测定每一管的RNasemRNA-oligo（dT）-纤维素，推进塞子，用无0为时准备洗脱。

OD260，当洗出液中OD或无倍柱床体积）的洗脱缓冲液2-32洗脱：

根据上表直接用注射器慢慢吸取适量（．4

柱床双蒸水到注射器内充分重悬RNasemRNA-oligo（dT）-至1/3纤维素，推进塞子以1/2体积分管收集洗脱液。

分钟，的洗脱液组分于RNAOD260测定每一管的5．，合并含有2-3，离心2500g4℃，纤维素。

oligo（dT）-上清转移至新的离心管中，去掉残余的．

6．沉淀：

洗脱液中加入1/10体积的3mol/LNaAc（pH5.2）,再加入2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀后，-20℃30分钟或放置过夜。

7．离心收集：

12000g,4℃离心15分钟，小心弃去上清，mRNA沉淀此时往往看不见，用70%乙醇漂洗沉淀，12000g,4℃离心5分钟，小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。

将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水，立即用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。

8．定量：

测定OD260和OD280，计算产率以及OD260/OD280的比率（同上一实验）。

【注意事项与提示】

1．整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境规则。

2．提取的总RNA必须完整，不能被降解，这是mRNA质量的先决条件。

3．总RNA与Oligo（dT）-纤维素的比例要适当，过量的总RNA，容易造成mRNA不纯。

4．RNA溶液与Oligo（dT）-纤维素结合前必须置于65℃加热5分钟，这一步很重要，其作用

（1）破坏mRNA的二级结构，特别是poly（A+）尾处的二级结构，使poly（A+）尾充分暴露，提高poly（A+）RNA回收率；

（2）解离mRNA与rRNA的结合。

加热后应立即插入冰上，以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。

5．应注意mRNA不能被DNA污染，即使是1ppmDNA污染，也可严重影响实验结果。

6．mRNA制备后，可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无DNA污染。

提取的mRNA应该在0.5~8.0kb之间呈现弥散状，无明显区带，但大部分的mRNA应在1-2.0kb范围内（如下图）。

一般来说，经过一次纯化分离的mRNA还会有微量的rRNA残留，但一般来说不会对后续实验造成很大的影响，如果样品充足，可将经过一次纯化分离的mRNA再纯化一次，进一步提高其纯度。

．

图3.1mRNA变性琼脂糖凝胶电泳示意图

Lane1,0.24–7.5kbRNA分子量Maker;

Lane2,老鼠肝脏总RNA;

Lane3,老鼠肝脏mRNA

7．为防止mRNA降解，应避免多次冻融，可将mRNA少量分装后保存。

另外，如果有低温冰箱,最好在-70℃～-80℃保存。

也可将mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。

8．寡聚（dT）纤维素柱用后可用0.3mol/lNaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3）冰箱保存，重复使用。

每次用前需用NaOH、灭菌ddH2O、层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。

9．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μgPoly（A+）RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。

【实验安排】

1．第一天：

试剂的配制和所用一次性