抗菌药物敏感性试验药敏试验.ppt

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抗菌药物敏感性试验抗菌药物敏感性试验（药（药敏敏试验）试验）内内容容简简介介介介药药物物物物选择选择及及及及报报告告告告K-BK-B法法法法操作方法操作方法操作方法操作方法报报告告告告方式方式方式方式影响因素影响因素影响因素影响因素稀稀稀稀释释法法法法EtestEtest联联合合合合药药敏敏敏敏试验试验20102010年年年年CLSICLSI更新内容更新内容更新内容更新内容简简介介介介目的目的指指导临床医生床医生针对各各类临床感染患者床感染患者选择最佳抗菌最佳抗菌药物物一定区域内一定区域内积累累对公共公共卫生有关的重要耐生有关的重要耐药的微生物流行病学的微生物流行病学资料料根据根据细菌菌对药物敏感物敏感谱进行菌种行菌种鉴定定药敏药敏试验原理试验原理把把含含有有定定量量抗抗菌菌药药物物的的纸纸片片贴贴在在已已接接种种测测试细菌的琼脂平板试细菌的琼脂平板上上纸纸片片中中药药物物吸吸收收琼琼脂脂水水分分溶溶解解后后通通过过弥弥散散作用形成递减的作用形成递减的浓度梯度浓度梯度纸片扩散法纸片扩散法纸纸片片周周围围一一定定距距离离范范围围内内试试验验菌菌生生长长受受抑抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。

制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。

抑抑菌菌环环大大小小反反映映测测试试菌菌对对测测定定药药物物的的敏敏感感程度程度抑抑菌菌环环大大小小除除与与细细菌菌的的敏敏感感性性有有关关外外还还与与其它诸因素相关。

其它诸因素相关。

定量定量测定抗菌药物活性测定抗菌药物活性抗抗菌菌药药物物与与肉肉汤汤或或琼琼脂脂培培养养基基混混合合稀稀释释后后种入试验细菌种入试验细菌，孵育，孵育过夜。

过夜。

以以能能抑抑制制细细菌菌生生长长的的最最低低浓浓度度为为最最低低抑抑菌菌浓度浓度（MICMIC）将将MICMIC与与机机体体血血清清或或体体液液中中可可获获得得药药物物浓浓度度相比较来确定恰当的临床相比较来确定恰当的临床疗效疗效稀释法稀释法MICMIC的对数与抑菌环直径关系的对数与抑菌环直径关系近似线性负相关近似线性负相关CLSI药物选择原则药物选择原则AA组组常规常规和首选药物，其结果应常规报告和首选药物，其结果应常规报告BB组组首首选选试试验验选选择择性性报报告告。

包包含含一一些些临临床床上重要的、特别针对医院感染的上重要的、特别针对医院感染的药物药物CC组组替代替代性和补充性药物性和补充性药物UU组组补补充充性性试试验验，仅仅用用于于治治疗疗泌泌尿尿道道感感染染的抗菌的抗菌药物。

药物。

表表中中小小框框内内是是一一组类似似药物物，其其结果果解解释和和临床床效力相似效力相似，不必个个，不必个个试验。

“或或”字字表表示示一一群群相相关关药物物，其其抗抗菌菌谱和和解解释结果果几几乎乎完完全全相相同同，交交叉叉耐耐药性性和和交交叉叉敏敏感感性性也也完完全全相相同同，通通常常只只选择一一种种药进行行试验。

药物选择菌种菌种代表药物代表药物苯苯苯苯唑唑西林西林西林西林葡萄球菌属葡萄球菌属葡萄球菌属葡萄球菌属所有所有所有所有-内内内内酰酰胺胺胺胺类类包括包括包括包括酶酶抑制抑制抑制抑制剂剂复合复合复合复合药药和碳青霉和碳青霉和碳青霉和碳青霉烯类烯类四四四四环环素素素素除葡萄球菌和除葡萄球菌和除葡萄球菌和除葡萄球菌和不不不不动动杆菌以外杆菌以外杆菌以外杆菌以外的所有菌属的所有菌属的所有菌属的所有菌属多西多西多西多西环环素、米素、米素、米素、米诺环诺环素、金霉素、金霉素、金霉素、金霉素、地美素、地美素、地美素、地美环环素、土霉素、美素、土霉素、美素、土霉素、美素、土霉素、美他他他他环环素素素素红红霉素霉素霉素霉素革革革革兰兰阳性球菌阳性球菌阳性球菌阳性球菌罗红罗红霉素、克拉霉素、阿霉素、克拉霉素、阿霉素、克拉霉素、阿霉素、克拉霉素、阿齐齐霉素、地霉素、地霉素、地霉素、地红红霉素霉素霉素霉素药敏试验中常用试验药及其代表的药物药敏试验中常用试验药及其代表的药物所有菌属所有菌属所有菌属所有菌属试验药物试验药物林可霉素林可霉素林可霉素林可霉素克林霉素克林霉素克林霉素克林霉素青霉素青霉素青霉素青霉素GG葡萄球菌属葡萄球菌属葡萄球菌属葡萄球菌属淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌苯氧甲基青霉素、苯氧乙苯氧甲基青霉素、苯氧乙苯氧甲基青霉素、苯氧乙苯氧甲基青霉素、苯氧乙基青霉素、氨基青霉素、氨基青霉素、氨基青霉素、氨苄苄西林、阿西林、阿西林、阿西林、阿莫西林、巴氨莫西林、巴氨莫西林、巴氨莫西林、巴氨西林、氨西林、氨西林、氨西林、氨环环己西林、海他西林、己西林、海他西林、己西林、海他西林、己西林、海他西林、羧苄羧苄西林、美洛西林、阿洛西西林、美洛西林、阿洛西西林、美洛西林、阿洛西西林、美洛西林、阿洛西林、替卡西林、林、替卡西林、林、替卡西林、林、替卡西林、哌哌拉西林拉西林拉西林拉西林头孢噻头孢噻吩吩吩吩肠肠杆菌科杆菌科杆菌科杆菌科头孢头孢匹林、匹林、匹林、匹林、头孢头孢拉拉拉拉啶啶、头头孢孢氨氨氨氨苄苄、头头孢孢克克克克罗罗、头孢头孢羟羟氨氨氨氨苄苄氨氨氨氨苄苄西林西林西林西林所有菌属所有菌属所有菌属所有菌属阿莫西林、巴氨西林、氨阿莫西林、巴氨西林、氨阿莫西林、巴氨西林、氨阿莫西林、巴氨西林、氨环环己西林、海他西林己西林、海他西林己西林、海他西林己西林、海他西林磺胺异磺胺异磺胺异磺胺异恶唑恶唑所有菌属所有菌属所有菌属所有菌属所有磺胺所有磺胺所有磺胺所有磺胺类类萘啶萘啶酸（敏感）酸（敏感）酸（敏感）酸（敏感）肠肠杆菌科杆菌科杆菌科杆菌科所有所有所有所有喹诺酮类喹诺酮类敏感敏感敏感敏感头孢噻头孢噻吩吩吩吩/头孢头孢唑唑啉（敏感）啉（敏感）啉（敏感）啉（敏感）肠肠杆菌科杆菌科杆菌科杆菌科所有所有所有所有头孢头孢菌素敏感菌素敏感菌素敏感菌素敏感万古霉素万古霉素万古霉素万古霉素革革革革兰兰阳性杆菌阳性杆菌阳性杆菌阳性杆菌替考拉宁替考拉宁替考拉宁替考拉宁氨氨氨氨苄苄西林西林西林西林肠肠球菌属球菌属球菌属球菌属青霉素青霉素青霉素青霉素B组组药物药物细菌菌对A组同同类药物耐物耐药，可，可选择性性报告告报告告指征指征特定的特定的标本来源本来源多种多种细菌感染菌感染多部位感染多部位感染对A组药过敏、耐受或敏、耐受或无效无效以流行病学以流行病学调查为目的向感染控制部目的向感染控制部门报告告C组组药物药物某某些些医医院院潜潜在在局局部部或或广广泛泛流流行行的的耐耐药菌菌株株对数数种种手手选药物物（特特别是是同同类的的如如-内内酰胺胺类或氨基糖或氨基糖甙类）耐）耐药治治疗对基本基本药物物过敏的患者敏的患者治治疗少少见菌的感染菌的感染流行病学流行病学调查为目的向感染控制部目的向感染控制部门报告告试验方法试验方法纸片扩散法纸片扩散法改良改良Kirby-BauerKirby-Bauer法法（K-B（K-B法法）培养基培养基培养基培养基非非非非苛氧菌苛氧菌苛氧菌苛氧菌用用用用Mueller-HintonMueller-Hinton（M-HM-H）琼琼脂脂脂脂药药物物物物纸纸片片片片直径直径直径直径6mm6mm纸纸片片片片，每片吸水量，每片吸水量，每片吸水量，每片吸水量约约2020llll菌菌菌菌液液液液比比比比浊浊管管管管0.50.5号号号号麦麦麦麦氏氏氏氏（McFarlandMcFarland）标标准准准准比比比比浊浊管管管管，菌菌菌菌液液液液浓浓度度度度为为1.51.5101088/ml/ml质质控菌株控菌株控菌株控菌株金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌ATCCATCC2592325923大大大大肠肠埃希菌埃希菌埃希菌埃希菌ATCCATCC2592225922铜绿铜绿假假假假单单胞菌胞菌胞菌胞菌ATCCATCC2785327853试验材料操作方法操作方法菌液制备菌液制备挑取已纯化挑取已纯化挑取已纯化挑取已纯化的的的的4455个菌落制备个菌落制备个菌落制备个菌落制备菌悬液菌悬液菌悬液菌悬液挑挑选琼脂平板上脂平板上35个形个形态特征一致的菌特征一致的菌落，用接种落，用接种环接触每个菌落接触每个菌落顶部部转移至移至45mL适宜的液体培养基中（如适宜的液体培养基中（如胰胰酶消化大豆消化大豆胨肉肉汤）生长法生长法置置35孵育孵育2-6h用用无无菌菌生生理理盐水水或或肉肉汤校校正正，使使其其浊度度至至0.5号麦氏管号麦氏管从孵育从孵育16-24h的非的非选择性性琼脂培养基脂培养基上用接种上用接种环挑取挑取单个新个新鲜菌落，菌落，悬浮浮于生理于生理盐水或肉水或肉汤中震中震荡混匀混匀与与标准比准比浊管比管比浊，以有黑字的白，以有黑字的白纸为背景背景调整其整其浊度相当于度相当于0.5号麦氏管。

号麦氏管。

直接调制菌悬液法直接调制菌悬液法生长法的简便替代法生长法的简便替代法生长法的简便替代法生长法的简便替代法用用无菌棉拭子蘸取菌无菌棉拭子蘸取菌液液在在管壁上方旋管壁上方旋转挤压几几次去掉次去掉过多水分多水分用拭子涂布整个用拭子涂布整个M-H培养基表面，反复培养基表面，反复几次，每次将平板旋几次，每次将平板旋转60最后沿平皿周最后沿平皿周边绕两圈以保两圈以保证涂布均匀涂布均匀平板接种平板接种制制备好的菌液必好的菌液必须在在15min内使用内使用贴纸片片前前可可将将培培养养皿皿盖盖半半开开3-5min以以使使表表面面过多水分被吸收但不超多水分被吸收但不超过15min将接种好的平板敞开盖子倒置在室温下干将接种好的平板敞开盖子倒置在室温下干燥燥3-5min使平板使平板上的水分被上的水分被琼脂完全脂完全吸吸收。

收。

用用镊子取子取纸片一片一张贴在在琼脂平板表面脂平板表面，轻压使其与使其与琼脂完全接触。

脂完全接触。

纸片中心片中心间距距24mm,纸片中心距平皿片中心距平皿边缘15mm。

直径。

直径90mm的平板最好的平板最好贴6张。

加贴纸片加贴纸片15min内将平板倒置内将平板倒置放温箱放温箱孵育孵育。

纸片片一一旦旦贴下下就就不不可可再再挪挪动位位置置，因因纸片中的片中的药物已物已扩散到散到琼脂中。

脂中。

需要需要时应在适当的地方在适当的地方贴新新纸片片注意必必须用用35孵孵箱箱（苛苛氧氧菌菌药敏敏平平板板应置置于于5%CO2环境）境）箱箱内内平平板板最最好好单独独摆放放，不不超超过两两个个叠叠在在一一起起，否否则中中间的的平平板板因因达达不不到到孵孵箱箱温温度度而而产生生预扩散的作用散的作用。

孵育孵育平平板板孵孵育育规定定时间（一一般般为18-24h）后后读取取结果果，葡葡萄萄球球菌菌和和肠球球菌菌必必须孵孵育育24h以以检测苯苯唑西林和万古霉素的耐西林和万古霉素的耐药性。

性。

孵育孵育16-18h后后检查每一每一块平板平板如如果果划划线满意意，接接种种物物准准确确无无误，抑抑菌菌圈圈应为正正圆形，菌落形，菌落应融合生融合生长出出现明明显单个个菌菌落落表表示示接接种种量量太太少少重重复复试验可可用用直直尺尺或或游游标卡卡尺尺，读取取最最接接近近的的整整毫毫米数米数测量量时应将将尺尺子子置置于于倒倒置置的的平平板板上上，置置平平板板在在黑黑色色无无反反射射光光背背景景上上方方几几厘厘米米处并并用用反反射光照明。

射光照明。

含含血血的的药敏敏琼脂脂应移移去去平平板板盖盖后后用用反反射射光光照明平板，于表面上方照明平板，于表面上方测量量抑抑菌菌环。

抑菌环直径测量抑菌环直径测量测量量抑抑菌菌环直直径径时抑抑菌菌环边缘以以见不不到到细菌菌明明显生生长为限限，测量量的的是是完完全全抑抑制制的的区区域直径（包括域直径（包括纸片直径）片直径）按按抑抑菌菌环直直径径判判断断细菌菌的的敏敏感感性性，应依依据据CLSI的的解解释标准准，报告告细菌菌对测试药物物敏敏感、中介、耐感、中介、耐药。

在清楚抑菌在清楚抑菌环内有独立的菌落生内有独立的菌落生长提示提示接接种种的的菌菌落落不不纯，需需要要重重新新分分离离、鉴定定和和药敏敏试验抗菌抗菌药物物选择出的高出的高频突突变耐耐药株株结果判断结果判断变形形杆杆菌菌属属的的菌菌株株可可扩散散到到