pcr反应模板的制备.docx

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pcr反应模板的制备

PCR反应模板的制备

　　PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量.模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基本技能，决定分离模板核酸（DNA或RNA）的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的关键是除去杂质（蛋白质、酶、脂肪等）.除去抑制TaqDNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的产量.

传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份，溶解细胞膜，使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用酚:

氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验用.但近几年来也发展了些简便实用较为有效的标本消化处理方法.亦可满足PCR实验的要求.采用哪种方法消化处理标本，视PCR实验的目的（是科研还是检测）及环境条件而定.

1微克人基因组DNA相当于3*10的五次方靶分子，

10纳克酵母DNA相当于3*10的五次方靶分子

1纳克大肠杆菌DNA相当与······

所以，扩增不同拷贝数的靶序列时，加入含靶序列的DNA量也不同

如真核核糖体RNA基因有200~500拷贝，反应中仅需加入0.5~2纳克人基因组DNA即可

以质粒DNA或染色体DNA为模板时扩增最适条件不同。

前者所需的酶量少，循环数少，温度不如染色体DNA要求严格。

模板核酸的提取制备方法

（一）蛋白酶K消化裂解法：

适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组织细胞（包括石蜡包埋组织）绒毛、毛发、精斑、血液（血清、血浆、全血）局部分泌物、尿，粪便等.

　　1.试剂

　　①蛋白酶K消化液:

10mmol/LTris.cl（PH8.0）

　　10mmol/LEDTA

　　150mmol/LNaCL

　　0.5%SDS

　　100～200ug/ml蛋白酶K.

　　②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中.

　　2.提取方法:

　　有些标本、在用蛋白酶K消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等.

　　临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混匀，55℃1～3小时，或37℃过夜.加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的氯仿:

异戊醇（49:

1）抽提一次，上清加入1/10体积的pH值5.23mmol/L醋酸钠缓冲液，加入2.5倍体积的冰冷无水乙醇（或加等体积的异丙醇）-20℃放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸弃或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1～2次，特别小心的吸弃或倒掉上清，真空或37℃温箱或室温干燥，加TE缓冲液20ul.溶解后，取3～8ul用于PCR扩增，或放-20℃保存.

　　蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白K消化处理标本，经离心处理后，吸取上清经95～97℃或煮沸10min灭活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR扩增.如杂质较多，还可经酚:

氯仿抽提后，即可用于PCR反应.此法蛋白质及其它杂质消除彻底，Taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性.但操作繁复，技术要求高.

（二）直接裂解法:

标本（组织细胞，分泌物）加PBS或生理盐水离心洗涤后，加消化裂解液20～50ul（0.5%NP-40和0.5%吐温-20），95～98℃，15～30min以裂解病原体，裂解细胞.然后12000r/min离心5～10min，取上清20～30ul用于PCR扩增.血清标本可直加等体积的消化液，加热处理离心后PCR扩增.亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解液，95℃30min消化处理，离心取上清，PCR扩增检测HBVDNA.

　　（三）碱变性法:

取血清20ul，加入1mol/LNaOH20ul，37℃30min，离心，加1mol/LHCl20ul，离心后，取上清5ul，用于PCR扩增.*亦有用10ul血清加NaOH至0.2mol/L，37℃1h，再加HCL中和离心后取上清10ul做PCR，其特异性和敏感性较前法更好.

　　（四）煮沸法:

经离心洗涤过的组织细胞，分泌物及血液标本，加适量无菌蒸馏水或PBS，混匀后，100℃煮沸10～15min，14000r/min10min，取上清做PCR.

　　（五）碘化钠法:

取组织细胞及抗凝血液10～100ul，加等体积的6MNaI，反复轻混20s，加等体积氯仿:

异戊醇（49:

1）振匀后，离心取上清加0.6体积的异丙醇，混匀后置室温3min.14000r/min10min，沉淀加10～100ul，TE溶解，取5～10ul做PCR，亦有用100ul血清加裂解液300ul（6MNaI，0.5%十二烷基肌酸钠，10ug糖原，26mmol/LpH8.0Tris-HCL，13mmol/LEDTA）混匀后，60℃15min，加等体积异丙醇，离心沉定后，加TE液用于PCR扩增，其产量和质量较高.

　　（六）异硫氰酸胍法

　　此法主要用于RNA的提取.标本为组织细胞及血清等.

　　1.异硫氰酸胍消化液

　　异硫氰酸胍4mol/L

　　柠檬酸钠（PH7.0）25mmol/L

　　十二烷基肌酸钠0.5%

　　β-巯基乙醇0.1mol/L

　　2.消化方法:

用50～100ul细胞悬液及血清，加等体积的异硫氰酸胍消化液振混匀后，或65℃1小时，或室温放置数分钟，然后加1/10体积的3mmol/LpH5.2的醋酸钠缓冲液，再加等体积的酚:

氯仿，用力振摇约10s，10000r/min，离心5min，取上清加等体积异丙醇-20℃放置3h后，14000r/min离心15min，沉定用75%冰冷乙醇离心洗涤1～2次，真空干燥，沉淀用TE缓冲液溶解即可用于逆转录PCR扩增，或放-20℃保存.

　　其它消化处理标本提模板核酸的方法有①异硫氰酸胍一二氧化硅法②异硫氰酸胍-玻璃粉法.③Chelex-100法.④全血直接扩增法⑤尿素消化裂解法.各有千秋，可根据情况选用.

特殊组织DNA的提取及鉴定

1、提取DNA的简易方法:

1）、从全血中提取DNA：

取20μl抗凝血于0.5ml无菌管中，加500μl左右的ddH2O混匀后，

12000rpm离心2分钟，弃上清，（若沉淀中仍有红细胞,需重复此操作1-2次）加入样品提取液20μl,混匀,100℃煮10分钟（可在扩增仪上进行）后12000rpm离心5分钟,取上清2μl进

行扩增。

2）、从其它有核细胞中提取DNA：

可直接加适量的样品提取液到装有发根、头屑、骨髓、精

子、组织碎片等有核细胞的管中,100℃煮10分钟（可在扩增仪上进行）后12000rpm离心5分

钟，取上清进行扩增。

2、从全血中用有机溶剂提取DNA：

1）试剂

a.10%SDS

b.2.0M醋酸钠

c.20mg/ml蛋白酶K

d.苯酚：

氯仿：

异戊醇（25:

24:

1）

e.分析纯乙醇

f.TE（10mMTris,1.0mMEDTA溶液,Ph7.5）

2）步骤

A、血液样本收集于含EDTA的抽血用管子中，样品用手倒转试管混合后等分。

每份700μl全

血可放在1.5ml的塑料离心管中，-70℃储存。

B、在解冻的（或液体的）血液中加入800μl的TE并混匀，12000rpm离心2分钟。

C、吸取1.0ml上清液并弃去。

D、加入1.0mlTE,振荡后离心2分钟,去除尽可能多的上清液,但不要影响沉淀。

E、向沉淀中加入：

375μl2M醋酸钠;25μl10%SDS;5μl蛋白酶K溶液。

略加振荡，于5

6℃保温一小时。

F、加入120μl苯酚/氯仿/异戊醇，振荡30秒。

G、12000rpm离心5分钟。

H、小心移出水相（上层）到一新的1.5ml的离心管中。

I、向水相中加入2.5倍体积预冷的分析纯乙醇，倒转试管加以混合，将试管于-20℃下放置

10分钟以上。

J、12000rpm离心10分钟。

K、倾去酒精，用移液器小心吸去剩余酒精，不要触动沉淀。

L、加180μlTE后振荡。

加20μl2M醋酸盐，手工混匀。

M、加500μl预冷分析纯酒精，用手轻轻混匀，12000rpm离心10分钟，倾去上清液。

N、用室温下的70%酒精1ml洗涤DNA沉淀,12000rpm离心5分钟，倾去上清液。

O、用移液器吸去残余的酒精，管子置于真空离心抽除残余的酒精（大约10分钟）。

或将管

子放在100℃以下烘干。

P、加200μlTE于DNA沉淀中，混匀后于4℃保温过夜（或56℃溶解DNA2小时以上），次日

清晨振荡10秒。

3、从斑痕材料中用有机溶剂提取DNA

1）试剂

a.斑痕抽提缓冲液（1.21gTris,5.84gNaCl,6.02g二硫苏糖醇，2%SDS,10mMEDTA/升,pH8.0）

b.其它试剂见2.1）

插入：

血液的模板制备：

取0.2毫升抗凝血液注入1.5ml离心管中，加1毫升细胞裂解缓冲液

c细胞裂解缓冲液：

0.32mol/L蔗糖

5摩尔每升的氯化镁，

1%TritonX-100

0.01mol/LTris.HCl

混匀，静置10分钟，3000g离心十分钟，弃上清，沉淀加50微升DNA提取缓冲液：

50毫摩尔每升的氯化钾

2.5毫摩尔每升的氯化镁

1毫克每毫升的明胶

0.5%NP-40

0.5%Tween-20

200微克每毫升的蛋白酶K

10毫摩尔每升的Tris.HCl

pH8.0

65摄氏度水浴1小时，12000g离心十分钟，弃沉淀，上清直接进行PCR反应

2）步骤

A、将斑痕剪成碎片后置于1.5ml的塑料离心管中。

B、加400μl斑痕抽提缓冲液及10μl蛋白酶K溶液，混匀，离心数秒使碎片浸入液体。

C、于56℃保温过夜。

D、用一新的灭菌牙签将碎片中的液体拧干后从管中取出。

E、加500μl苯酚/氯仿/异戊醇，手摇混匀，12000rpm离心3钟。

F、将上清液转移到新的离心管。

G、上清液中加入2.5倍体积预冷的分析纯酒精。

H、手摇混匀试管中的各种成分，放置-20℃10分钟以上。

I、12000rpm离心10分钟。

J、倾去酒精。

K、用1ml室温的70%酒精洗涤。

L、12000rpm离心5分钟。

M、倾去酒精，用移液器吸去残余酒精。

N、真空离心10分钟除去残余酒精，或在100℃以下烘干.

O、56℃下用36μlTE溶解DNA，时间至少2小时。

4、从精斑中分离提取DNA

1）试剂

a.TNE缓冲液（1.21gTris,5.84gNaCl,0.37gEDTA/升）

b.20%sarcosyl

c.0.39M二硫苏糖醇

d.其它试剂见2.1）

2）步骤

A、从棉签上取下有检材的棉花并置于1.5ml塑料离心管中。

B、管中加入400μlTNE缓冲液；25μl20%sarcosyl;75μl水；5μl蛋白酶K溶液。

手摇混

匀，37保温2小时。

C、用一新的灭菌牙签将棉花拧干后从管中取出，再用12000rpm离心5分钟。

D、移上清液（内含裂解细胞或"雌性"片段）于一新的1.5ml管，不要振荡沉淀物（内含非

裂解细胞或精子）。

再用TNE洗脱沉淀物四次。

E、在有沉淀的管中加入10μlTNE;50μl20%sacrosyl;40μlDTT;150μl水；10μl蛋白酶K

溶液。

手摇混匀，37℃保温2小时。

F、按3，2）E～O的方法分别抽提出两管中的雌性DNA和精子DNA。

5、用Chelex从全血/血斑中抽提DNA

1）试剂

a.TE

b.5%Chelex100（w/v于无菌水中）

2）步骤

A、3μl全血或3mm×3mm的血斑置于灭菌的1.5ml离心管中，加入灭菌的1mlTE于管中，振荡

数秒。

B、置于室温30分钟，振荡数秒。

C、用12000rpm离心3分钟。

D、弃上清液，保留足够上清液盖没沉淀，勿搅起沉淀。

E、加入200μl5%Chelex，振荡数秒。

F、于56℃保温30分钟。

G、振荡数秒。

H、沸水浴8分钟。

I、振荡数秒。

J、用12000rpm离心5分钟，上清中为提取的DNA。

6、用Chelex从精斑中抽提DNA

1）试剂

a.TE

b.10mg/ml蛋白酶K

c.20%Chelex100（w/v于无菌水中）

d.洗脱缓冲液（10mMTris,10mMEDTA,50mMNaCl,2%SDS,Ph7.5）

e.1M二硫苏糖醇

2）步骤

A、将附有检材的棉签或纤维置于1.5ml灭菌离心管中，加1ml灭菌的TE，振荡数秒。

B、室温30分钟。

C、振荡数秒。

D、用一新的灭菌牙签将残片拧干后从管中取出。

E、用12000rpm离心3分钟。

F、弃去上清液，但保留约50μl上清液，勿使"细胞沉淀"搅起（若沉淀体积较大，应保留

更多上清液，在此例中，保留的上清液体积应为沉淀的2倍）。

G、加150μl灭菌的蒸馏去离子水和2μl蛋白酶K溶液。

H、56℃保温1小时以裂解非精子细胞。

I、用12000rpm离心5分钟，沉淀为"精子沉淀"。

J、取150μl上清液（含裂解细胞组分）及到一新的1.5ml离心管中，再加50μl20%Chele

x，振荡数秒后，稍加离心，然后接步骤O～S进行操作。

K、用0.5ml洗脱缓冲液重新悬浮原管中的沉淀，略加振荡,用12000rpm离心5分钟，弃去

约450μl上清液。

L、重复步骤K再洗四次。

M、用1ml灭菌的蒸馏去离子水重新悬浮沉淀，稍经振荡，用12000rpm离心5分钟，弃去

950μl上清液。

N、加150μl的5%Chelex，2μl蛋白酶K溶液，7μl1M的二硫苏糖醇于"精子组分"，振

荡数后，稍加离心。

O、56℃保温1小时。

P、振荡各管数秒。

Q、样品于沸水浴8分钟。

R、振荡数秒。

S、用12000rpm离心3分钟，

绒毛：

绒毛样品离心2分钟，弃上清，沉淀用TE缓冲液洗二次

悬于50微升裂解液中强烈震荡，煮沸2分钟，；离心后取上清进行PCR扩增。

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