生物化学实验文档格式.docx
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※实验一
（2）糖的还原作用
【实验目的及要求】
掌握糖的还原反应来鉴定糖的原理和方法。
费林（Fehling）试剂和本尼迪（Benedict）试剂均为含Cu2+的碱性溶液，能使具有自由醛基或酮基的糖氧化，其本身则被还原成红色或黄色的Cu2O，此法常用作还原糖的定性或定量测定。
实验仪器：
水浴锅
实验器皿：
吸管、试管
硫酸酮、氢氧化钠、酒石酸钾钠、柠檬酸钠、无水碳酸钠、淀粉、蔗糖、葡萄糖。
1.费林试剂
试剂A：
CuSO4·
5H2O34.5g,溶于蒸馏水并稀释至500ml。
试剂B：
氢氧化钠125g，酒石酸钾钠137g，溶于蒸馏水并稀释至500ml。
临用时将试剂A与试剂B等体积混合。
2.本尼迪试剂：
柠檬酸钠（Na3C6H3O7·
11H2O）及50g无水碳酸钠，溶于400ml蒸馏水中。
另溶解8.5g硫酸铜于50ml热水中。
将硫酸铜溶液缓缓加入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如有沉淀可过滤。
此混合液可长期使用。
于3支试管中加入费林试剂A和B各1ml，混匀，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，观察各管的变化。
另取3支试管，分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%淀粉溶液1ml，然后每支试管加本尼迪试剂2ml，置沸水浴中加热数分钟，取出，冷却，和上面结果比较。
※实验一（3）总糖的测定——蒽酮比色法
【实验目的】
1、学习蒽酮比色定糖法的原理和方法。
2、学习721型分光光度计的原理和操作方法。
总糖是指样品中的还原单糖及在本法测定条件下能水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解为葡萄糖的淀粉。
蒽酮比色法是测定样品中总糖量的一个灵敏、快速、简便的方法。
其原理是糖类在较高温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糠醛衍生物后与蒽酮（C14H10O）缩合成蓝色化合物。
溶液含糖量在每mL150μg以内，与蒽酮反应生成的颜色深浅与糖量成正比。
蒽酮不仅能与单糖也能与双糖、糊精、淀粉等直接起作用，样品不必水解。
721型分光光度计为上海第三分析仪器厂产品。
采用自准式光路，单光束方法。
其波长范围为360～800nm，用钨丝白炽灯为光源。
由灯泡发出的连续辐射光线，经过聚光透镜会聚后，再经过平面镜转900角。
光线反射后，经入射狭缝而入射到单色器内。
狭缝正好位于球面准直物镜的焦面上。
当入射光线经过准直物镜反射后，就以一束平行光射向棱镜，并在其中色散。
入射角在最小偏向角，入射光在铝面上依原路反射回来，再经过准直物镜反射，而会聚在出光狭缝上。
由狭缝出来的光通过被测的溶液，再射到GD-7型光电管上。
GD-7型光电管的锑、铯、钾、钠阴极面对整个可见光区都较敏感（光谱灵敏范围为350～850nm）。
光电管受光后所产生的光电流，经过一组高值电阻（50M、500M、1KMΩ），在电阻两端形成一个电压降，通过电压降的测定来间接地测量光电流的变化。
【器材】
1、试管（或具塞试管）及试管架2、吸量管（1mL、10mL）
3、沸水浴4、冰浴5、721型分光光度计
【试剂和材料】
1、蒽酮试剂（1000mL）:
称取100mg蒽酮溶于100mL98%硫酸溶液（A.R）中，用时配制。
2、葡萄糖标准溶液（100μg/mL）：
精确称取100mg干燥葡萄糖，用蒸馏水定溶至1000mL。
3、样品溶液：
可自选待测物制成样品溶液。
举例：
称取500g市售白薯，洗净切碎后用多功能食品加工机磨成浆，4层沙布压虑，去滤液留渣，将渣放入烘箱内80～850C烘干后，再用植物粉碎机（微型）研细，过筛，取100目筛下物为待测样品。
取样品在烘箱内1050C烘干，恒重后，精确称取1～5g，置于锥形瓶中，加入80mL沸蒸馏水，放入沸水浴。
不时摇动，提取半小时。
取出立即过滤，残渣用沸蒸馏水反复洗涤并过滤，合并滤液。
冷却至室温，用蒸馏水定溶至100mL。
【实验操作】
1、制作标准曲线取7支干燥洁净的试管，编号后按下表操作。
试剂（mL）编号
1
2
3
4
5
6
7
葡萄糖标准溶液（100μg/mL）
0.10
0.20
0.30
0.40
0.60
0.80
H2O
1.0
0.90
0.70
蒽酮试剂
10
每管加入葡萄糖标准溶液和水后立即混匀，迅速置于冰浴中，待各管都加入蒽酮试剂后，同时至于沸水浴中，准确加热7分钟，立即取出置冰浴中迅速冷却。
待各管溶液达室温后，用1cm厚度的比色皿，以第一管为空白，迅速测其余各管的光吸收值。
然后以第2管～7管溶液含糖量μg数为横坐标，吸光度（A620nm）为纵坐标，画出含糖量与A620nm值的相关标准曲线。
2、测定样品的含糖量取4支试管编号，按下表操作。
样品溶液
10.0
10.o
其它操作与制作标准曲线相同。
将2～4管测出的A620nm平均值，根据A620nm平均值从标准曲线上查出相应的含糖μg数，在换算成100g样品中总糖含量。
【注意事项】
1、所配制的样品溶液必需透明，样品中如有蛋白质，对实验有影响，须设法除去。
2、在操作中必须严格控制反应过程的温度和加热时间。
3、在使用浓硫酸时一定要格外小心，防止硫酸溅到身上而损坏衣服。
※实验二纸层析法分离鉴定氨基酸
1、学习分配层析的原理；
2、掌握氨基酸纸上层析的操作技术。
层析法也叫色谱法，是一种物理分离方法，它是利用混合物中各组分的物理、化学性质的差异，使各组分以不同的程度分布在两个相中，其中一个相为固定相，另一个相则流过此固定相（称流动相）并使各组分以不同的速度移动从而达到分离。
层析法是近代生物化学最常用的分析方法之一，运用这种方法可以分离性质极为相似而用一般化学方法难以分离的各种化合物。
如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。
层析法有许多种类，根据分离所依据的理化性质不同，可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等。
纸层析是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定；
也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗生素等物质的一中分离分析工具。
纸层析属于分配层析法。
分配层析法是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数的不同而得到分离。
纸层析以滤纸作为惰性支持物，滤纸纤维素上的羟基具有亲水性，能吸附一层水，把吸附在滤纸上的水作为固定相，展层用的有机溶剂为流动相。
层析时，将样品在距离滤纸2~3cm的某一处（原点），在密闭的容器中层析溶剂沿滤纸的一个方向反复抽提，由于混合氨基酸在两相中的分配系数（当把一种物质在两种不相溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀分配。
达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比为一个常数，即所谓的分配常数）不同，使不同的氨基酸分布在滤纸的不同位置上而得到分离。
物质被分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上移动的速率用Rf表示。
Rf=原点到层析点中心的距离（X）÷
原点到溶剂前沿的距离（Y）。
在一定条件下某种物质的Rf值是一个常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度有关。
【器材与试剂】
1、器材：
层析缸、点样毛细管、小烧杯、培养皿、量筒、喷雾器、吹风机（或烘箱）层析滤纸（新华1号），直尺、铅笔、针线、一次性手套。
2、试剂：
（1）扩展剂（水饱和的正丁醇和乙酸的混合物。
其中水为固定相，正丁醇为流动相，乙酸为层析提供酸性环境。
）
具体配制方法：
将20mL正丁醇和5mL乙酸（4：
1）放入分液漏斗中，与15mL蒸馏水混合（即所得混合液再按体积比5：
3与蒸馏水混合）,充分振荡，静止后分层，放出下层水层，取漏斗内的扩展剂约5mL置于小烧杯中做平衡剂，其余的倒入培养皿中备用。
（2）氨基酸溶液：
0.5%的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液（各组分的浓度均为0.5%）。
（3）显色剂：
0.1%水合印三酮正丁醇溶液。
【操作方法】
1、制备扩展剂并将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。
2、准备滤纸
取层析滤纸（长22cm，宽14cm）一张，在纸的一端距边缘2~3cm处用铅笔划一条直线，在直线上每间隔2cm作一记号，为点样位置。
3、点样：
用毛细管将各氨基酸样品分别点在点样处，干后再点一次。
点样量以30~40μL为宜，点样时，用毛细管吸取氨基酸样品，与滤纸垂直方向轻轻碰点样处，每点在纸上扩散的直径不超过3mm。
4、扩展：
用线将点好样品的滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触（避免由于毛细管现象使溶剂沿两边移动过快而造成溶剂前沿不齐，影响Rf值）。
将盛有约20mL扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端朝下，扩展剂的液面需低于点样线1cm），待溶剂上升15~20cm时取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，用吹风机吹干（注意温度不宜过高，以免损坏氨基酸）。
5、定性鉴定：
用0.1%水合印三酮正丁醇溶液在纸的一面均匀喷雾，然后置烘箱中烘烤5分钟（100oC）即可显示出各层析斑点。
用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，用一直尺测量每一显色斑点中心与原点的距离和原点到溶剂前沿的距离，求其比值，即得各种氨基酸的Rf值。
在层析图谱上，对比标准氨基酸的位置（Rf值）而确定氨基酸混合样品中氨基酸的种类位置
6、计算各种氨基酸的Rf值。
【注意事项】1、取滤纸之前要将手洗干净，防止手上的汗渍污染滤纸，并尽可能少接触滤纸；
在条件允许的情况下也可戴一次性手套拿滤纸。
要将滤纸平放在干净的白纸上，千万不要放在实验台上，以防止污染。
2、点样点的直径不能超过0.5cm，否则分离效果不好，并且样品用量过大，会造成“托尾巴”现象。
【思考题】
1、纸层析法的原理是什么？
2、何谓Rf值？
影响Rf值的主要因素是什么？
3、怎样制备扩展剂？
4、层析缸中平衡剂的作用是什么？
5、氨基酸极性与Rf值的关系？
附：
影响Rf值的因素
1、物质结构的影响：
极性物质易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。
例如酸性和碱性氨基酸的极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此Rf值低于后者。
氨基酸的极性愈大，Rf值愈小。
—CH2—基是疏水性基团，如果分子中极性基数不变，则—CH2—基增加，整个分子的极性降低，因此易溶于有机溶剂（流动相）中，Rf值也随之增加。
例如氨基酸的Rf值：
甘氨酸〈丙氨酸〈亮氨酸；
二羧基氨基酸中，天门冬氨酸〈谷氨酸。
极性基团的位置不同也会引起Rf值变化。
2、溶剂的影响：
同一种物质在不同溶剂中Rf值不同，选择溶剂系统时应该使被分离物质在适当Rf值范围内（0.05-0.85之间），并且不同物质的Rf值至少差别为0.05才能彼此分开。
溶剂的极性大小也影响物质的Rf值，在用与水互溶的脂肪醇作为溶剂时，氨基酸的Rf值随着溶剂碳原子数目的增加而降低。
3、pH的影响：
溶剂系统地pH会影响物质极性基团的解离形式。
对于酸性氨基酸则在酸性时所带净电荷比碱性时少。
带电荷愈少亲水性愈小，因此在酸性溶剂中Rf值较碱性大。
而碱性氨基酸则与此相反。
借此性质用酸相和碱相溶剂进行双向层析，可使酸碱性不同的氨基酸达到分离的目的。
溶剂的pH还可以影响有机溶剂的含水量，溶剂酸碱度大，则含水量高。
对于极性物质来说Rf值增加，非极性物质则减少。
若pH值不适合，使同种物质有不同解离形式，其Rf值也略有不同，则此物质层析呈带状图谱。
因此溶剂中的酸或碱的含量必须足够，并且层析缸中用酸或碱气体饱和才可以防止上述现象，使物质得到圆点状图谱。
4、滤纸的影响：
层析滤纸必须质地均匀、紧密、有一定机械强度，并且杂质较少，如纸中有Ca2+、Mg2+、Cu2+等金属离子杂质，可与氨基酸形成络合物使层析图谱出现阴影，可用稀酸洗涤滤纸除去之。
5、温度和时间的影响：
温度不仅影响物质在溶剂中的分配系数，而且影响溶剂相的组成及纤维素的水合作用。
温度变化对Rf值影响很大，所以层析时最好在恒温室中进行，控制温度相差不超过±
0.5oC。
当所有条件相同时，氨基酸层析时间短，Rf值则小。
除上述影响因素外，样品中含有盐份和其它杂质以及点样过多均会影响样品的有效分离。
※实验三血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
熟悉醋纤薄膜电泳方法及其在分离血清蛋白中的应用，了解电泳技术的一般原理。
【实验原理】
蛋白质是兼性离子。
由于组成蛋白质分子的氨基酸种类和数目不同，各种血清蛋白质的分子量和等电点也不相同。
在同一条件下（电场强度、电渗、温度、缓冲液pH和离子强度等），它们电泳速度各不相同，因而可以分离。
本实验以醋酸纤维薄膜为支持物，利用血清中蛋白质颗粒的等电点大部分低于7，在缓冲液pH8.6中带负电荷，在电场中向正极移动，电泳后根据血清蛋白移动快慢，可依次分为清蛋白、球蛋白的α1、α2、β、γ五个区带，染色后显出清晰色带。
由于各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比，可将各色带剪开，分别溶于碱性溶液中，用分光光度法计算各种蛋白质的百分数，也可以将染色后的膜条直接用光密度计测定。
图1正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图
1为清蛋白，2，3，4，5分别α1-，α2-，β-及γ-球蛋白，6为点样原点
醋酸纤维薄膜电泳（celluloseacetatemembraneelectrophoresis）具有微量、快速、简便及分辨率较高等优点，广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶的分离和测定。
醋酸纤维薄膜与滤纸相比较，有以下优点：
（1）醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量测量的精确性。
（2）快速省时。
由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲溶液也较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45——60min即可，加上染色、脱色，整个电泳完成仅需90min左右。
（3）灵敏度高，样品用量少。
血清蛋白电泳仅需2μL血清，甚至加样体积少至0.1μL，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离区带。
临床医学检验利用这一特点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。
（4）应用面广。
某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白的等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。
（5）醋酸纤维薄膜电泳染色后，经冰乙酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。
【试剂】
1、巴比妥缓冲液（pH8.6，离子强度0.075）
称取巴比妥钠15.45g，巴比妥2.76g，用蒸馏水配成1000ml。
2、染色液
氨基黑10B0.25g，甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml混合配制（可重复使用）。
3、漂洗液：
95％乙醇45份，冰醋酸5份，蒸馏水50份。
4、0.4moL/LNaOH洗脱液：
取4克NaOH加蒸馏水至250ml。
5、透明液
冰醋酸25-30ml加95％乙醇70-75ml。
6、新鲜无溶血血清。
电泳仪（包括整流器与电泳槽）与分光光度计或光密度计、染色缸、醋酸纤维薄膜（2×
8cm）、点样器、10ml吸管、大试管等、培养皿、滤纸、镊子、直尺、铅笔、剪刀等。
【操作】
1、准备：
用镊子取2×
8cm醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上用笔作上记号），在膜的粗面一端1.5cm处用铅笔轻划一横线，表示点样位置，将膜浸入巴比妥缓冲液中充分浸透（约20分钟），取出，夹在两层粗滤纸内吸去水分，，然后平铺在玻璃板上，膜的粗面朝上。
另在电泳槽两边盛入巴比妥缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，取两层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。
作为滤纸桥。
2、点样：
用1.5cm宽的玻片末端或点样器蘸上一层血清，紧印在膜粗面点样线上使血清全部渗入膜内。
图2醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图
虚线处为点样位置
3、电泳：
将膜点样面向下，两端拉紧贴于电泳槽架的滤纸桥上，点样端在阴极，盖上槽盖，静置平衡5-10分钟后通电。
电压先90v，10分钟；
120v，50分钟（约10v／cm／长）电流0.4-0.6mA／cm宽，约45-60分钟关闭电源。
若连续数次电泳，每次正负电极应转换。
图3电泳装置剖视示意图
1.滤纸桥2.电泳槽3.醋酸纤维素薄膜4.电泳槽膜支架
5.电极室中央隔板
人血清蛋白质的等电点及迁移率
蛋白质名称
等电点
泳动脉/（cm2·
V-1·
S-1）
分子量
清蛋白
4.88
-5.9×
10-5
69000
α1-球蛋白
5.06
-5.1×
200000
α2-球蛋白
-4.1×
300000
β-球蛋白
5.12
-2.8×
9000-150000
γ-球蛋白
6.85-7.50
-1.0×
156000-300000
4、染色与漂洗：
电泳完毕，取出膜条，直接浸入氨基黑10B染色液中，染色3-5分钟取出薄膜，立即浸入漂洗液中，时时漂盈，漂洗3-4次至背景无色为止，用蒸馏水冲洗后放室温凉干或放100℃以下干燥箱烘干。
【实验说明】
1、醋纤薄膜电泳血清蛋白正常值：
清蛋白（A）：
55-74％，α1球蛋白2-5％，α2球蛋白4-9％，β球蛋白6.5一12％，γ球蛋白12-20％，肝硬化时清蛋白显著降低，γ球蛋白升高2-3倍，肾病综合征时清蛋白质降低，α2、β球蛋白升高。
2、1957年Kohn首先用醋酸纤维薄膜电泳后，因其有微量快速、操作简便，分离清晰、电渗小无拖尾等优点，可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、血红蛋白、结合球蛋白及同功酶的分离和测定，应用日渐广泛。
但在实际应用过程中，因影响因素较多：
电压电流、电泳时间、血清加量、醋纤膜质量、染料质量和浓度、染色时间和染料应用的次数，漂洗的次数及每次间隔的时间、缓冲液的离子强度、透明液的醋酸浓度等都可影响醋纤膜电泳分析的结果。
所以要完成好的电泳图谱有一定的难度。
因此在实验中要注意解决以下几个问题：
（1）电泳图谱不齐或分离不良
这是电泳分析中最常见的问题，多数是由于血清滴加不均匀或滴加过多，也有因薄膜质量不合要求所致。
点样这一步非常关键，一定要按操作步骤进行。
首先选择质匀、孔细、染料吸附少的薄膜充分浸透缓冲液至湿度均匀无干白点。
然后将滤纸吸去薄膜表面的多余水份，使薄膜含水量饱和均匀，这样才能防止薄膜表面液体含量不均，水份移动而引起标本移位。
点样前注意关闭门窗和风扇，因空气流通快可使标本和水份蒸发而影响电泳图形。
点样要力求做到均匀迅速，在实践中把点样器干沾血清，改为沾取标本前先浸入蒸馏水中沾湿用吸水纸吸干后再沾血清，这样点样器内均匀沾取血清的效果较干沾为佳。
（2）电泳图谱出现条痕
问题是由于点样后薄膜过干，或因电泳槽密闭性不良，或电流过大，温度升高，薄膜水份蒸发干燥而造成的。
因此薄膜一定要充分浸透后才能点样，并注意检查电泳槽是否盖紧，电泳槽要放在远离光源热源的阴凉之处。
在电泳过程中随时观察电压电流的变化，因通电后产生一定的热量，电流会有所增加。
控制电压100～110V，电流0.5～0.6mA/cm，电泳时间一般冬长夏短，以区带展开3.5～4cm即可（另加一条溴酚蓝预染血清，同样操作，指示区带展开的距离）。
（3）区带拖尾或区带过于紧密
缓冲液的离子强度低于0.05即出现区带拖尾现象，离子强度>
0.075则区带过于紧密。
此时需要检查更换缓冲液。
常规操作一般使用连续电泳巴比妥盐缓冲液pH8.6，离子强度0.06。
电泳槽中缓冲液经10次使用后，不应简单地采取交换电极的方法，而是将缓冲液取出重新混合过滤后，再进行使用，一般用4个周期后需更换新液。
离子强度愈低，区带展开愈长，电泳速度愈快。
电泳区带展开的距离也跟薄膜数量有关。
在教学实验中，经常发现薄膜愈少，展开的距离愈短，区带愈清晰的现象。
在仪器输出电压相同的情况下，薄膜愈少，加在薄膜两端的电压愈高，电压高会使展开的长度缩短。
只要薄膜数量在5条以上，即可使图谱展开长度有较好的重现性。
（4）区带一边长一边短呈现扭曲现象
这是薄膜两边电阻不一样，电阻大的一边电流小，速度慢，区带展开短。
造成这种现象的原因是薄膜未紧压在电泳槽的滤纸桥上，使薄膜接触不良而增大了电阻。
在操作过程中，一定要注意使薄膜两端紧压在滤纸桥上。
（5）γ球蛋白区带倒退
这是电渗作用引起的。
可升高点样端的缓冲液面高度或适当加大电流量克服之。
（6）染色后白蛋白中间色浅
有些同学在实验中往往急于求成，染色时间未到便匆忙取出薄膜漂洗，结果造成了白蛋白区带中间色浅的现象。
造成这种现象的另一个原因是白蛋白含量过高。
可增加染色时间或减少点样量解决之。
（7）染色后区带清晰度不良
陈旧标本可使区带分离清晰度大为降低。
应尽量当日标本当日做，最多不超过2天。
另外标本不可溶血，因溶血标本中血红蛋白与β球蛋白的电泳区带相重迭。
可造成β球蛋白含量升高而蛋白质含量相对减少的结果。
（8）白蛋白区带染色不均并有空泡
这是染色液陈旧所致，染色液存放和使用过久，会降低蛋白质结合染料的能力。
发现正在使用的染液已陈旧时，应立即全部弃去，更换新液。
（9）透明时膜发白不能完全透明
薄膜未干或透明液中醋酸
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