树脂法纯化10羟基喜树碱的工艺研究Word文档格式.docx

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（二）10-羟基喜树碱的研究现状4

二、树脂纯化10-羟基喜树碱的工艺研究5

（一）仪器与材料5

1、仪器5

2、材料与试剂6

（二）检测方法6

（三）样品溶液的制备6

（四）树脂的预处理6

（五）树脂含水率的确定6

（六）吸附-解吸附实验6

1、吸附量和吸附率的测定6

2、吸附量、吸附率和解析率的计算6

3、洗脱剂浓度对解吸附率的影响7

4、pH对吸附能力的影响7

5、温度对吸附能力的影响7

6、吸附时间对吸附能力的影响7

7、树脂用量对吸附能力的影响7

（七）吸附-解吸附实验7

（八）结果与讨论7

1、洗脱剂浓度对解析率的影响7

2、pH值对吸附能力的影响8

3、温度对吸附能力的影响8

4、吸附时间及树脂用量对吸附率的影响9

（九）吸附-解析附9

1、X-5树脂的泄漏曲线9

2、X-5树脂洗脱曲线10

三、结论11

参考文献12

一、前言

（一）喜树概况

喜树（CamptothecaacuminataDecne）,为蓝果树科（Nyssaceae）喜树属（CamptothecaDecne）的落叶乔木，高达20余米，为我国特有植物。

19世纪末20世纪初，喜树曾天然分布于长江流域及长江以南诸省，主要生长在低山、丘陵及平原的河流两岸、溪旁、林缘、山坡和稻田边。

但喜树一直是毁林开田的砍伐对象，所以喜树的野生种群已相当少见。

现在喜树在种植方面已经施行GAP管理方法，使开发与保护相结合、药用与非药用相结合，走一条绿色、科学、可持续发展的道路。

喜树最重要的价值是它全身各个部位如种子、叶、花、枝条、树皮、根均含有喜树碱（Camptothecine）和10-羟基喜树碱（10-hydroxycamptothecine）,在民间喜树的果实、皮、根、枝和叶均可入药，有抗癌、散结、清热、杀虫的功能[1]。

用于食道癌、胃癌、直肠癌、肝癌、膀胱癌、卵巢腺癌、慢性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、血吸虫病肝脾肿大等。

喜树的根部中除含有喜树碱、还含有喜树次碱（Venoterpine）即印度鸭脚树碱、鞣花酸-3，3’，4-三甲醚（3，3’，4-Tri-O-methylellagicacid）及9-谷甾醇，干木中含10-甲氧基喜树碱（10-methoxycamptothecine）和10-羟基喜树碱，果实中除含有喜树碱、10-羟基喜树碱、去氧喜树碱（Deoxy-eamptothecine）、喜树次碱外还含有白桦脂酸（betulicacid）、长春苷内酰胺（vincoside-lactam）等（用现代技术提取抗癌活性成分喜树碱的研究）。

世界卫生组织已经把喜树碱衍生物的研究作为抗癌药物的主攻方向之一。

自1996年美国FDA批准第一个喜树碱类抗癌新药拓扑替康上市后，伊诺替康、9-氨基喜树碱、10-羟基喜树碱等新药不断问世，成为一大类重要临床用抗肿瘤制剂[2-6]。

（二）10-羟基喜树碱的研究现状

羟基喜树碱（10-羟基喜树碱，10-hydroxycamptothecin,HCPT）,是喜树碱天然衍生物20多种单体中抗癌活性最强的一种。

羟基喜树碱化学结构与喜树碱相似，10位碳原子上氢为羟基所取代。

羟基喜树碱全称（S）-4，9-dihydroxy-4-ethyl-1H-pyrano[3’,4’,6,7]indolizino[1,2]quinoline-3,14（4H,12H）dione,分子式C20H10N2O5，结构式见图1，分子量为364.36，黄色棱柱状结晶，微溶于甲醇、氯仿、吡啶，不溶于水，溶液具荧光，熔点258-263℃[7]。

羟基喜树碱：

R=OH

图110-羟基喜树碱结构式

1965年3月，Wall[8]等人从喜树树干中首次分离得到喜树碱，研究表明喜树碱临床治疗胃癌、膀胱癌、白血病等恶性肿瘤有一定疗效，但由于喜树碱毒性较大，可以引起食欲不振、恶心、呕吐等不良反应，及制成水溶性钠盐后抗癌活性下降等原因，使人们对喜树碱研究一度中止。

直到1985年，Hsiang等发现喜树碱可以阻断癌细胞中拓扑异构酶I（TopoisokmeraseiI，TopoI）的合成。

由于TopoI在癌细胞中的含量大大高于正常组织，而且在S期癌细胞中活性增大，因此抑制TopoI的药物可以选择性抑制增殖期肿瘤细胞的DNA复制，并且研究还表明，喜树碱是通过与TopoI-DNA可裂解复合物（Cleavablecomplex）可逆结合，形成喜树碱-TopoI-DNA三联体，从而稳定了可裂解复合物，使DNA的复制不能进行下去，导致癌细胞死亡[9]。

正是喜树碱独特的抗癌机理，掀起了喜树碱研究的新高潮。

10-羟基喜树碱是喜树碱分子第10位碳原子的氢被羟基取代，是喜树碱的天然衍生物。

动物实验证明，10-羟基喜树碱作用于S期，为细胞周期特异性药物，可以阻止细胞进入分裂期，从而使癌细胞凋亡。

而且10-羟基喜树碱比喜树碱毒性低，毒副作用小，成为喜树碱类衍生物研究重要的中间体[10-11]，从而得到人们的青睐，但是天然10-羟基喜树碱含量非常低，目前市场上主要以合成、发状根培养和生物转化为主，从喜树中直接得到10-羟基喜树碱非常困难[12]。

在分离纯化方面，10-羟基喜树碱的分离纯化方法主要有：

萃取法、离子交换树脂和薄层层析、大孔吸附树脂等。

自10-羟基喜树碱研究以来由于合成工艺繁琐、周期长、生产效率低等因素的影响，使其大多无实际生产价值，不能够满足市场的需求，目前为止仍然是从天然喜树资源中获取10-羟基喜树碱的唯一来源。

二、树脂纯化10-羟基喜树碱的工艺研究

大孔吸附树脂是20世纪60年代发展起来的一类新型高分子材料，具有良好的吸附性能，进入90年代后，大孔吸附树脂的应用日趋广泛，尤其在分离纯化中草药活性成分方面显示出极大的优越性[13，14]。

本文通过用不同溶剂不同条件筛选对大孔吸附树脂X-5分离纯化喜树果实中抗癌活性成分10-羟基喜树碱的工艺进行研究，取得了满意的结果，为10-羟基喜树碱的研究提供了有效依据。

（一）仪器与材料

1、仪器

SHIMADZULC20A高效液相色谱仪（日本岛津公司），WastersXbridgeC18色谱柱（4.6×

25cm,5μm,），UV-2550型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；

玻璃层析柱φ10mm×

400mm，振荡器、RE-52AA旋转蒸发仪（天津玻璃仪器厂）,，pH计，纯水仪。

2、材料与试剂

X-5大孔吸附树脂（南开大学化工厂）10-羟基喜树碱标准品（纯度98%，购自SIGMA公司），乙腈，乙醇均为色谱纯（德国Merk），三氟乙酸色谱纯（TFA），纯水（纯水仪制备）。

（二）检测方法

检测波长254nm，流速1ml/min,进样量10μl,流动相为0.05%TFA乙腈:

0.05%水（3：

7，v/v）。

（三）样品溶液的制备

喜树碱提取液，浓缩后二氯甲烷萃取,萃余液拉干除去残留二氯甲烷和乙醇，滤除不溶物，得清液即为样品溶液[15]。

（四）树脂的预处理

根据10-羟基喜树碱的结构和性质，参考相关文献，本实验选取树脂X-5对10-羟基喜树碱吸附能力最好的树脂进行工艺研究。

首先将树脂用无水乙醇浸泡24小时，充分溶胀，再用无水乙醇按1：

10的体积比于回流装置提取1小时，取出过滤，如此重复4-5次，用蒸馏水洗净乙醇。

将5%的盐酸溶液以2BV/h流速通过树脂进行酸洗，而后水洗至中性。

再用2%的氢氧化钠溶液以2BV/h流速进行碱洗，用水洗至中性，同时用紫外分光光度计检测淋洗下来的蒸馏水，在200nm处无吸收峰时，即处理完毕[15]。

（五）树脂含水率的测定

处理好的树脂滤除水分，置于具塞广口称量瓶中平衡水分24小时，然后取5g湿树脂于70℃烘箱减压干燥至恒重，计算含水率，见表1。

表1树脂含水率测定结果

树脂名称

X-5

含水率（%）

63.7%

（六）吸附-解吸附实验

1、吸附量和吸附率的测定

选取已处理好的X-5大孔吸附树脂0.5g（以绝干计），再加入100ml吸附母液，常温下摇床振荡5小时，取上清HPLC测定吸附前后10-羟基喜树碱浓度的变化，按照公式

（1），

（2）计算各树脂的静态吸附量和吸附率。

2、吸附量、吸附率和解析率的计算

（1）

（2）

（3）

其中：

Qe-吸附量；

C0-初始浓度；

Ce-平衡浓度；

Vi-加入样品液体体积；

W-树脂干重；

E-吸附率；

D-解析率;

Cd-洗脱液浓度；

Vd-洗脱液体积[16,17]。

3、洗脱剂浓度对解吸附能力的影响

用体积分数55%、60%、65%，70%、75%和80%乙醇分别对X-5树脂进行洗脱，测定解析液中10-羟基喜树碱的浓度，按公式（3）计算解吸附率。

4、pH对吸附能力的影响

测定原母液的pH值，分别用10%盐酸和3%氢氧化钠溶液调节原母液的pH值分别至2、3、4、5、6、7、8、9、10，然后分别加入0.5g树脂（以绝干计算），常温摇床振荡2小时，吸附后，HPLC分别测定原母液中10-羟基喜树碱含量和pH值，确定最佳pH值。

5、温度对吸附能力的影响

取绝干树脂0.5g,加入40ml母液分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、和70℃摇床振荡，180rpm,60min。

测定10-羟基喜树碱含量。

6、吸附时间对吸附能力的影响

取绝干树脂0.05g，0.1g，0.3g，加入40ml母液在20℃，摇床震荡，240min,每隔半小时取样一次，测定10-羟基喜树碱含量。

7、树脂用量对吸附能力的影响

步骤参考（六）吸附解吸附实验中6吸附时间对吸附能力的影响。

（七）吸附-解吸附实验

将母液以一定的流速通过装有树脂的φ10mm×

400mm的玻璃层析柱，测定流出液中10-羟基喜树碱的浓度，考察母液流速对树脂吸附性能的影响，绘制泄露曲线，确定最佳吸附条件。

对已吸附样品的树脂进行解吸附实验，洗脱溶剂的浓度、流速等对树脂解析附能力的影响，绘制洗脱曲线[15]。

（八）结果与讨论

1、洗脱溶剂浓度对解吸附能力的影响

室温下，吸附相同量10-羟基喜树碱的X-5树脂分别用体积分数55%、60%、65%、70%、75%和80%乙醇溶液进行洗脱，结果见图2。

图中表明75%的乙醇溶液解析率所得10-羟基喜树碱含量较高。

图2乙醇体积分数对X-5解析效果的影响

2、pH值对吸附能力的影响

由于，pH值决定10-羟基喜树碱的电离结构，所以在吸附过程中母液的pH值对树脂的吸附能力的影响至关重要。

由图3看以看到随着pH值的不断增大吸附率逐渐提高，树脂吸附率达到最大，然后再逐渐降低。

这是由于母液的pH值为强碱性时10-羟基喜树碱又内酯型式转为羧酸型式，所以10-羟基喜树碱含量降低，吸附率减小；

当母液pH为强酸时，10-羟基喜树碱被质子化所以导致10-羟基喜树碱含量降低，吸附率变小。

所以树脂X-5在母液pH为5时，10-羟基喜树碱吸附率最高[15]。

图3不同pH对树脂X-5吸附10-羟基喜树碱的影响

3、温度对吸附能力的影响

图4可以看出随着温度的升高树脂X-5对10-羟基喜树碱的吸附率逐渐增大，到50℃时吸附率达到饱和。

就一般而言吸附是放热的，只要达到了吸附平衡，升高温度就会使吸附量下降。

但在低温时，有些吸附过程在一定时间内达不到平衡，而温度升高会使吸附率加快，从而吸附量增加。

大孔吸附树脂对10-羟基喜树碱吸附时，被吸附的10-羟基喜树碱处于伸展状态，所以这类吸附是一个吸热过程，温度升高会增加吸附量。

图4不同温度对树脂X-5吸附10-羟基喜树碱的影响

4、吸附时间及树脂用量对吸附能力的影响

我们选取了与室温相差不多的20℃，分别对0.05g,0.1g和0.3g的树脂在不同时间里取样，检测树脂X-5对10-羟基喜树碱的吸附率。

结果表明，0.1g树脂在1.5h内吸附10-羟基喜树碱最多，吸附率最好。

图5不同质量不同时间下的树脂X-5吸附10-羟基喜树碱的影响

（九）吸附-解析附

1、X-5树脂的泄漏曲线：

样品溶液分别以2BV/h、5BV/h和10BV/h的流速在同一实验条件下（吸附温度为室温）进行吸附考查，不同流速下X-5树脂泄漏曲线如图所示。

结果表明，3种流速以5BV/h效果最佳。

图6树脂X-5泄漏曲线图

2、X-5树脂洗脱曲线

分别采用2BV/h、5BV/h、10BV/h的流速，75%乙醇溶液连续洗脱已经吸附相同量的羟基喜树碱的X-5树脂，结果显示5BV/h时效果较好。

图7树脂X-5洗脱图

三、结论

图8X-5树脂吸附前后溶液中10-羟基喜树碱的HPLC谱图分析

本论文采用大孔吸附树脂吸附的方法，对不同参数下树脂X-5对10-羟基喜树碱吸附-解析附工艺的详细研究，从吸附条件、温度、洗脱溶剂，不同时间不同质量树脂吸附等参数的筛选，确定了小试的条件，为进行放大试验，生产，最终建立一种低成本、高提取、环境污染小的10-羟基喜树碱最佳生产工艺提供了有力依据。

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