CART 细胞治疗产品质量控制检测研究及非临床研究考虑要点Word文档格式.docx
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行）》为基本要求，从如何开展CAR-T细胞产品的质量控制检测研究和非临床评价两个方面提出指导性意见，为CAR-T细胞产品研发者提供技术参考，使我国CAR-T细胞产品领域从起步即能够按照一定的规范开展研究，为未来的产业化打好基础。
同时，本技术考虑要点也会随着CAR-T细胞产品各方面研究的不断成熟而不断进行修订，从而逐步建立更为科学合理的CAR-T细胞产品的质量控制检测及非临床评价的要求及标准。
二、适用范围
1、本技术要点适用于哪类CAR-T细胞产品？
目前有多种方法用于T细胞修饰及CAR-T细胞产品制备，包括病毒载体转导
（如γ-逆转录病毒载体或慢病毒载体）及非病毒载体转染（如mRNA转染、Transposons转染等）等，虽然已开展的临床试验中以病毒载体转导的方式为主，但以非病毒载体转染的方式也在不断得到青睐，因此，本考虑要点主要以病毒载体和非病毒质粒载体的基因修饰方式制备的CAR-T细胞治疗产品为主要对象，但共性的部分也可为其它类基因修饰方式制备的CAR-T细胞参考。
2、本技术要点包括哪些内容？
本技术考虑要点按照CAR-T细胞产品的制备工艺顺序，提出了各阶段工艺研究及质量控制的关注点及检测要求的考虑，并提出了产品非临床评价研究需要开展的内容及所用方法，主要包括原辅料选择、转导基因载体或转染基因载体的制备及质量控制、细胞供体筛选及检测、CAR-T细胞制备工艺研究、工艺过程控制、细胞产品质量控制要求以及非临床评价研究的动物模型、有效性及安全性评价方法等，不仅提出一般要求，也对重点环节提出有针对性的考虑。
3、本技术考虑要点的基本原则是什么？
CAR-T细胞产品是基因治疗与细胞治疗技术的结合，一方面，它具有基因治疗可能潜在的风险，如因存在基因整合或细胞复制的可能而带来二次肿瘤的风险，
另一方面，由于CAR-T细胞的制备是以人作为供体采集初始细胞材料才能进入工艺过程，由于每个个体，特别是肿瘤患者，因其初始细胞会因为肿瘤类别及所处分期、所接受过的治疗、采集样本时的身体状况或与上一次治疗的间隔时间、以及每个患者的T细胞的亚群的比例等有明显的差异，即使采用已经进行过充分验证的工艺，仍然难以保证每个个体所制备的目的细胞都是一致的。
因此，本技术考虑要点一方面要考虑产品的安全性及有效性，另一方面更从各个工艺阶段突出一致性的要求，以最大限度的降低产品的可变性。
三、原材料和辅料及其质量控制：
1、在CAR-T细胞产品的原材料和辅料通常都要考虑哪些因素？
生产CAR-T细胞产品的原材料是指其生产过程中所用的所有生物原材料和化学原材料，它们不是CAR-T细胞产品的目标组成成份，如培养基、PBMC分离试剂、T细胞分选试剂、激活剂、细胞因子（如IL-2、IL-7及IL-15）、血清或血清替代物等。
而CAR-T细胞产品的辅料是指其产品配方中所使用的辅助材料,是其细胞产品中的成份，如人血白蛋白、人血小板提取物、冻存液（如DMSO）等。
一个完整CAR-T细胞产品的制备过程包括基因载体物质的制备及CAR-T细胞终产品的制备两个大的生产环节，同时，载体物质的制备又包括了质粒载体制备和/或病毒载体制备工艺过程，因此，在考虑选择原材料时，不仅要考虑CAR-T细胞产品制备过程中所用的原材料，也要考虑基因载体物质制备过程中所用的原材料（不包括生产的起始原材料，如细胞基质和菌毒种），如细菌及细胞培养基、牛血清、添加因子、转染试剂（如钙转试剂、PEI、Lipo2000等）以及核酸酶等等。
如果在CAR-T细胞生产过程中还使用了自制的试剂和材料，还要考虑制备这些自制试剂中所用的原材料。
在早期的基础研究时，研究者对原材料及辅料的关注可能不足，但由于原材料和辅料对产品的质量及安全性均有重要影响，因此，一旦准备进入产品开发阶段，研发人员就要尽早开展原材料及辅料的评估及筛选，而且在临床过程中要进一步开展相关的研究，在确证性临床前应完成充分的质量评估工作。
2、转导/转染T细胞的病毒载体/质粒载体是否可按照原材料管理？
CAR-T细胞是基因治疗的exvivo方式，通过病毒载体转导或质粒载体转染，将CAR基因转入T细胞中从而获得CAR-T细胞，虽然它们未转染的部分在后续的T细胞扩增及洗涤过程中经验证可被去除，但其所携带的遗传物质则是CAR-T细胞的重要组成部分且是使T细胞具有肿瘤杀伤活性的重要基础，这一点与生产中所用的原材料的特性完全不同，其质量对CAR-T细胞具有重要影响，因此，转导
/转染T细胞的病毒载体/或质粒载体按照产品的理念进行管理更为合理。
但同时也还需要考虑到，也正是因其不直接进入患者体内，在后续的细胞扩增及CAR-T制剂工艺中会有稀释或洗涤步骤，因此，通过验证可证明后续工艺可以降低其残留的风险，则可以结合工艺验证的结果制定更为合理的质量控制标准。
3、如何进行原材料和辅料的选择和风险控制？
在CAR-T细胞制备过程中使用的原材料有药用级别的（如IL-2），也有非药用级别的（如IL-7）；
有的原材料在国外被批准用于药品生产但尚未在国内获得注册，如某种CD3/CD28磁珠；
有的同一种试剂分别存在药用级别和非药用级别，非药用级又分为GMP级别及研究用级别；
有的试剂是生物源性材料，如病毒制备中会用到的牛血清和胰酶；
有的试剂甚至要自行制备等，面对如此复杂的情况，CAR-T细胞产品的研究者就需要考虑采用何种方法选择以及控制原材料。
原材料的选择是基于风险评估的原则，通过风险评估从而建立与之相应的风险控制策略，通常会有以下几种考虑：
（1）在产品研发早期就开始设计所用原材料的类别并分析其可能的风险，可根据我国现行版《中国药典》三部中“生物制品生产用原材料及辅料质量控制规程”及国外相关技术要求对原材料的风险等级进行评估并分类，同一种试剂或材料，优先选择低风险级别的，如药用无菌制剂优于药用制剂，药用级优先于非药用级、GMP级优先于非GMP级、非动物源性优先于动物源性材料等；
（2）根据对每一种原材料风险评估的结果建立相应的质量检测项目、检测方法及放行标准，并在产品研发过程中不断分析关键原材料质量对产品质量的影响，并不断改进关键原材料的质量要求；
（3）对于研究级别的生物源性的原材料，不仅要设置它们的安全性质控项目，如无菌、内毒素、支原体、分枝杆菌及外源病毒污染的检测等，还要考虑它们的纯度、效价或对细胞活化、增殖的生物学效力的质控项目。
动物源性材料的质量控制，如牛血清，需至少按照已有的国家标准或要求进行原材料质控及放行；
（4）对于自行研制的原材料，如某种特殊要求的细胞因子，不仅需要建立质量标准，还需要有制备工艺及其工艺验证等数据支持，有的高风险的原材料甚至可能还会要求开展动物体内的安全性评估。
此类原材料的检测要求需要根据其使用方式、下游工艺的清除验证数据以及潜在风险来确定。
辅料的选择及控制要求同样是基于风险评估的原则，因辅料是与CAR-T产品一同进入患者体内，因此，选择低风险的辅料以及严格控制辅料风险是基本原则，如一种辅料同时存在几种风险等级来源时，应选用风险等级低的辅料；
对于高风险等级的辅料,应在产品研发的早期评价使用这些辅料的必要性,并寻找其他替代物或替代来源。
4、在载体物质或CAR-T细胞终产品中是否需要进行原材料残留的质量检测？
在载体物质或CAR-T细胞终产品中是否进行原材料的残留控制，主要考虑两个方面，一个是根据原材料的风险级别，评估载体纯化工艺或CAR-T细胞制备工艺对其去除的能力，二是对于风险高的原材料除了评估去除能力外，还需要在载体或CAR-T细胞产品制备的最适工艺阶段或终产品中进行残留量检测的控制并建立控制标准，如慢病毒工艺中使用的降解DNA的核酸酶Benzonase的残留控制，牛血清白蛋白残留量的检测等。
四、病毒转导载体及质粒转染载体制备及质量控制：
1、转导/或转染载体制备的起始原材料包括哪些或如何定义转染载体的起始原材料？
对于γ-逆转录病毒载体（如GALV）来说，通过多质粒瞬时共转染一包装细胞获得具有感染性的病毒颗粒，再将此病毒感染另一包装细胞，该包装细胞已稳
定转染了可产生逆转录病毒颗粒的病毒必需基因，因此，通过克隆筛选后，可获得稳定生产高滴度逆转录病毒载体的细胞株，如可生产GALV病毒载体的PG13细胞，这一稳定转染的细胞即是生产病毒的起始原材料。
对于慢病毒载体来说，多采用三质粒或四质粒瞬时转染包装细胞（如293T/17或293T细胞）的方法制备病毒载体，在这个体系中，含有CAR基因的穿梭载体、慢病毒包装辅助元件的二个或三个辅助质粒载体以及包装细胞均是制备慢病毒载体的起始原材料。
但同时，对于这些含有不同目的基因的质粒来说，菌种又是质粒生产的起始原材料，所以对于慢病毒载体，其起始原材料的定义要延伸到制备质粒的菌种，质粒在此系统中为慢病毒制备的中间产物。
未来如果研究者可以开发出生产慢病毒的稳定转染的细胞株，此时，就可以将慢病毒的起始原材料仅定义为细胞。
对于使用质粒转染系统（如Piggybac）的非病毒载体，其起始原材料是指生产含CAR基因质粒的菌种。
2、起始原材料要建立种子库系统吗？
是的。
对于能够建立库系统的起始原材料，均应采用二级或三级种子库系统
（种子、主库和工作库），因每一支冻存样品均具有群体代表性，故种子库具有良好的均质性，而且可以进行充分的质量检定，从而最大程度地控制污染风险；
同时，由于种子库系统具有足够的数量，可为长期生产提供稳定的来源，因此，采用种子库系统是质粒载体及病毒载体生产一致性的重要保证之一。
用于生产病毒载体的稳定转染细胞（如含CAR基因的PG13细胞）及瞬时转染的细胞（如HEK293、293T或293T/17）均需建立细胞库系统，即细胞种子，MCB和/或WCB；
用于制备非病毒转染方式的质粒、慢病毒载体所需的穿梭质粒及辅助质粒的细菌，均需建立菌种库体系，即主种子库和/或工作种子库。
因不同穿梭载体可使用相同的辅助质粒载体共转染获得慢病毒载体，因此，辅助质粒载体菌种种子批的保存数量可相应增大。
如对原亲本细胞进行了克隆筛选、无血清驯化、基因改造等改变细胞特性的操作，应通过在原细胞名称后增加后缀等方式重新命名细胞，以区别于原细胞，并重新建立细胞库用于病毒载体的生产。
此外，在构建病毒载体稳转细胞过程中使用的瞬时转染细胞或包装细胞亦建议采用细胞库体系，并至少进行细胞鉴别、细菌、真菌、支原体污染检查及一般外源病毒污染的检查。
3、如何建立种子库系统？
如何确定各级种子库的代次及数量？
通常情况下，种子库系统按照原始种子/细胞种子、主库及工作库进行管理，原始种子库/细胞种子用于制备主库、主库用于制备工作库。
当每年的细胞的使用量不多时，可以采用种子和主库两级管理。
用于生产的种子库系统必须符合种子库的质量要求。
无论是建立菌种库还是细胞库，其重要的一点是保证均质性，即从种子或主库中取1支或几支细菌或细胞复苏，按照规定的培养条件扩增到一定数量后，在同一次操作中，将处于相同倍增水平的细菌或细胞收集后重悬于保存液或冻存液中，合并于同一个容器，然后无菌分装到菌种保存管/或细胞冻存管中，并在适当的条件下保存。
菌种库/或细胞库应选择最稳定的保存方法，如菌种尽可能以冻干的方式保存，细胞通常在液氮（如气相）中保存，或超低温保存（-180度及以下）。
以包装慢病毒的293T/17细胞为例，将细胞种子复苏后，按照固定的比例传代至处于相同倍增水平的足够建库的细胞量（如均处于第N代），挑选出状态良好的细胞，在同一次操作中，将这些细胞消化、离心收集，将细胞用冻存液重悬后合并在同一容器中，混合均匀，按照规定的量分装到冻存管中，按照经过验证的程序冻存后保存于液氮或其它超低温设备中，这样获得的任何一支冻存管中的细胞均可代表这一批细胞。
在建库过程中，将虽然处于相同的倍增水平，但是在不同次操作中制备的冻存细胞不能作为同一个库管理，如将处于同一倍增水平的细胞分别在两个不同的时间点冻存，或在同一时间收集但分别在不同的容器中混匀后分装、均不能作为同一个库管理。
主库和工作库的代次、每一支的装量以及保存的数量需要根据种子的特性、生产能力和生产稳定性、预期的规模和预期的产品生命周期等因素综合考虑，如在产品开发早期，可建立相对小的工作库，以满足产品药学、临床前及临床研究的需要，而到了上市阶段，甚至是从确证性临床开始，则需要考虑产品的预期生命周期，生产规模以及每年的产能等，选择建立一个相对大的工作库更为合理。
种子库的更换属于生产变更的范围，更换主库通常会被认定为较大的变更，特别是对于那些经过基因修饰操作的细菌或细胞，如从原有的种子库或主库中重新挑选克隆建立新的主库的操作即属于风险较高的变更，需要进行全面的评估。
但工作库可以根据年度使用情况，从主库中重新制备新批次的工作库，并按照规定的要求检定合格后使用。
4、种子库的质量要求是什么？
如何管理种子库？
（1）菌种库的质量要求：
菌种库的质量检测主要包括：
菌种鉴别及纯度、活菌数、质粒基因序列、质粒保有率及稳定性等。
菌种的鉴别及纯度需采用不同的方法联合检测，包括通过培养，检测其菌落的形态以及是否有杂菌生长；
将细菌染色，通过镜检法检测其菌的形态及染色特性；
通过生化反应可检测菌种的生化特性，这些方法可证明所用菌种是本菌，无其它菌的污染。
通过检测质粒序列、拷贝数及限制性酶切图谱证明菌种中的质粒含有目的元件及相应的拷贝数，通过检测质粒的保有率验证菌种的稳定性并限定菌种使用的传代水平。
因辅助质粒在真核中表达，因此，在菌种检定时不必要检查其插入基因表达的水平。
除此，还应对菌种进行杂菌及噬菌体的污染检查，以保证菌种的安全性。
近年来，随着技术的发展及对药品质量要求的提高，为监测菌种的稳定性，开始增加生产用菌种全序列背景资料的要求，因此，研究者可根据研究的进度逐步开展相关的研究工作。
（2）细胞库的质量要求：
《中国药典》三部生物制品通则《生产用动物细胞基质制备及检定规程》中规定了细胞基质的质量要求，包括细胞鉴别（种属、株及专属特性）、外源因子污染检查（包括非病毒性及病毒性内外源因子）、成瘤性及致瘤性检测、染色体核型、均一性以及稳定性等，但对于每种特定细胞来说，需设置更具体的检测项目。
由于生产CAR-T细胞病毒载体的细胞主要有稳转的PG13-CAR细胞、HEK293、293T或293T/17，它们是已知体内具有成瘤性的细胞，293T细胞已有多种重组产品的研发经验，且CAR-T细胞产品主要用于目前尚无有效手段治疗的肿瘤患者，而且病毒载体不直接进入患者体内，所以在细胞库检定中主要进行细胞鉴别、外源因子污染检查，可以不进行其成瘤性及致瘤性检测，但在转染载体中要考虑细
胞残留成分的检测，如宿主DNA及细胞蛋白的检测。
但如果使用新的细胞时，作为细胞特性鉴别的特征之一，还是要考虑进行成瘤性检测。
对于稳转的PG13-CAR细胞，除种属鉴别外，其鉴别试验中要包括特定插入基因的鉴别（如插入基因序列、拷贝数等），同时，由于其为鼠源细胞，所以在进行细胞库的充分评估时，特定外源病毒检测项还要进行鼠源病毒的检测，而逆转录病毒的检查则可以直接采用电镜检查其逆转录病毒颗粒以及感染试验进行复制型逆病毒病毒RCR污染的检测。
另外，由于生产病毒载体的PG13-CAR是稳转细胞，还需要评估其传代稳定性，通过插入基因、病毒包装及包装病毒滴度等参数进行细胞的稳定性分析，以限定其包装病毒所用的最高生产用代次。
对于慢病毒载体的包装细胞，如HEK293、293T或293T/17，可通过种属、细胞株STR图谱以及SV40大T抗原等进行鉴别。
如对细胞进行了新的基因修饰，则需增加修饰特征的鉴别。
但需要注意的一点是，由于293类细胞属于遗传不稳定细胞，对细胞进行克隆筛选、无血清驯化、遗传操作、甚至长时间传代时易造成STR图谱的变化，如原有等位基因位点的重复数发生变化、在原STR图谱数据上可能会有一个或两个STR位点出现新的三等位基因峰等，因此，需通过系统分析细胞特性变化过程中的STR图谱从而重新建立其特征性图谱。
但如果多个位点出现三等位基因峰时，则表明该细胞与其它人源细胞发生了交叉污染，不得用于病毒包装。
（3）种子库的管理：
在《中国药典》三部中明确规定了菌种库及细胞库的管理要求，包括细菌或细胞一旦从库中移出，不得再回冻至库内；
研究用菌种或细胞与生产用的菌种或细胞要严格分开存放；
需建立台账、冻存容器的监测及维护等。
5、如何考虑质粒载体的生产工艺及规模？
质粒载体的质量控制包括哪些？
制备质粒载体时，从工作种子批取一支或几支菌种复苏，逐级扩大培养后（培养过程中不应再使用抗生素等具有筛选压力的试剂）进行质粒提取，经纯化及除菌过滤后成为质粒批。
质粒的纯化工艺会随着产品研发的进展而不断提高，如在研发早期或早期临床时可能采用质粒提取试剂等进行质粒载体的纯化，但随着临床研究的进展，制备慢病毒载体的质粒或转染T细胞的质粒载体则需要考虑工业
化的质粒生产方式，包括连续发酵工艺、柱纯化工艺等，并开展质粒生产工艺验证研究，包括对杂质清除能力的验证研究。
对于用非病毒系统的质粒转染载体来说，因直接用于T细胞转染，还需要考虑质粒的制剂配方工艺，如制剂缓冲液配方既要保持质粒的稳定性，又要减少对T细胞的风险，同时还需要尽可能符合产品制剂的要求。
生产质粒菌种的传代次数应有菌种传代稳定性数据的支持，应采用能保证从菌种库工作种子批代次复苏后传代至质粒载体生产所用的细菌代次尽可能少的生产工艺，且在CAR-T上市后，用于制备慢病毒载体的质粒的菌种传代次数应不高于工艺验证的最大传代次数；
同时需要考虑每个质粒的生产规模应与慢病毒载体及CAR-T细胞预期规模相匹配，为了提高生产的一致性，单批次质粒应有足够的量可以满足制备多批次的慢病毒载体及CAR-T细胞。
质粒的质量控制通常需要考虑质粒鉴别、含量、纯度（包括DNA形式及杂质）、无菌、内毒素等，对于直接用于转染T细胞的质粒载体，还需要考虑质粒的细胞转染效率。
其中，质粒鉴别检查时，尽管在菌种库质量控制中进行了质粒的基因序列测定且进行了菌种稳定性的研究，但在质粒质控时仍需进行质粒序列测定或限制性酶切法对质粒进行鉴别，确认质粒结构及序列的正确性。
质粒的纯度控制包括两个方面，一方面控制质粒本身的质量，如可采用OD260/OD280的比值、电泳法或液相法等，不仅可以控制质粒所占的百分比，还可分析及监测质粒的不同形式，如超螺旋、解螺旋及线性的比例，不同质粒状态比例的控制主要是考虑对慢病毒包装效率以及T细胞转染效率的影响，并可作为质粒批间一致性的控制；
另一方面，纯度的检测还应包括对工艺杂质的控制，如宿主菌蛋白残留、宿主菌DNA残留以及工艺中添加的其它需要控制的成份。
为控制质量检测的有效性，研究者应在产品研发过程中建立质粒参比品，用于质粒鉴别、纯度及细胞转染效率检测的控制。
质粒保存的稳定性研究也是质粒质量控制的一个重要参数，通过分析不同保存时间及不同保存温度下质粒的不同形式比例的变化、对T细胞转染效率的影响确定质粒使用的有效期。
6、病毒载体的生产规模要设计多大？
是否可以采用细胞培养皿进行病毒载体的培养？
关键工艺研究包括哪些？
病毒载体制备过程中如何降低牛血清的风险？
病毒载体规模的设计需要根据单次感染T细胞所需要的病毒量、质量检测所需要的量、留样量、病毒载体的稳定性以及预期的年度病毒用量等因素综合考虑。
在临床试验过程中，一方面因在评估CAR-T细胞产品的同时也要评估病毒载体工艺及其稳健性，需要使用不止一个批次的病毒载体制备CAR-T细胞，另一方面，由于T细胞供体的个体差异大，为减少病毒批次一致性不足造成的影响，又不应使用过多批次的病毒载体，因此病毒生产规模的设计要同时兼顾这两方面的需要。
而对于上市后CAR-T细胞的制备，在病毒载体保存稳定性数据的支持下，采用大规模制备的病毒载体更有利于产品的安全性、有效性及一致性。
产品早期研究时，研究者可能会采用培养皿进行病毒载体的制备，但对于生产临床用病毒载体来说，这种培养方式引入污染的风险相对较大，因此，制备临床用的病毒载体应采用尽可能封闭的系统，如细胞工厂或生物反应器。
对于γ-逆转录病毒载体，因可建立稳转细胞系，如PG13细胞生产GALV病毒载体，在生产病毒载体时，从工作细胞库中取出1支或多支冻存细胞复苏，合并后接种于适当的培养瓶，逐级扩大培养，收获培养上清即可获得γ-逆转录病毒载体悬液。
而制备慢病毒载体时，目前主要是采用三质粒或四质粒共转染的方法，从WCB取一支或多支包装细胞，扩增至所需数量后，加入适当比例的辅助质粒载体及穿梭质粒载体共转染细胞，培养一定时间后收获上清，即获得慢病毒载体悬液。
为获得高滴度的病毒，应开展病毒培养工艺的研究，包括不同阶段细胞培养用液、辅助质粒与穿梭质粒的比例、质粒转染方法及所用试剂（如磷酸钙、PEI或其它转染试剂如lipofect2000等）、转染时间及效率、病毒收获时间及收获次数，病毒悬液保存条件等关键工艺参数，并进行验证。
因逆转录病毒载体的稳定性相对较差，在4-8℃保存及反复冻融均会明显降低病毒的感染滴度，所以，在工艺设计时应考虑采用培养及纯化的连续工艺，以减少中间品保存的时间，同
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