引物设计的一些要素Word文件下载.docx

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它保证引物与模板的稳定结合。

选择有合适稳定性的引物能在确保不产生非特异性条带的前提下尽量降低退火温度。

五、SecondaryStructures二级结构

二级结构是引物设计中必须考虑的一个重要因素。

二级结构能显著影响反应中能与模板正确结合的引物数量，发卡结构的存在能限制引物与目的位点的结合能力，从而降低扩增效率，形成发卡环的引物则不能在PCR扩增中发挥作用。

六、Hairpin发卡结构

发卡结构的形成是由于引物自身的互补碱基分子内配对造成引物折叠形成的二级结构，并由于发卡结构的形成是分子内的反应,仅仅需要三个连续碱基配对就可以形成。

发卡结构的稳定性可以用自由能衡量。

自由能大小取决于碱基配对释放的能量以及折叠DNA形成发卡环所需要的能量，如果自由能值大于0则该结构不稳定从而不会干扰反应，如果自由能值小于0则该结构可以干扰反应。

七、Dimer二聚体

引物之间的配对区域能形成引物二聚体，它是相同或不同的两条引物之间形成的二级结构。

它造成引物二聚体扩增并减少目的扩增产物，二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向引物之间形成，如果配对区域在3末端问题会更为严重，3末端配对很容易引起引物二聚体扩增。

八、FalsePriming错配

如果引物可以结合除目的位点外的其他区域，扩增效率将明显降低目的产物带将减少或出现涂布（smear）。

3末端连续几个碱基配对形成错配的倾向要高于引物上游区域同样数量的碱基配对，在使用引物设计软件时，您可以分别设定确认为错配的3末端或引物全长形成连续碱基配对的数量。

顺便说一下，如果是新手，刚开始接触引物设计，推荐使用PrimerPremier5.0，因为它界面简单，易学易用；

如果你想把引物设计得尽善尽美，公认的首选软件是Oligo，其次我认为是DNAstar。

Oligo功能强大，所以使用起来就没有PrimerPremier5.0那么简便。

先用PrimerPremier5.0设计，然后把设计好的引物拿到Oligo里去检测这对引物的优劣，我想这对大多数引物设计者是一个不错的选择！

补充一：

具体说一下引物中GC含量问题

引物的GC含量一般为40-60%，以45-55％为宜，过高或过低都不利于引发反应。

有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近（上下游引物的GC含量不能相差太大），以有利于退火温度的选择。

如果G-C比例超出，则在引物的5’端增加As或Ts；

而如果A-T比例过高，则同样在5’端增加Gs或Cs。

但也有认为：

原来普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率的观点其实是不对的，以人基因组DNA为模板，用81%AT的引物可以产生单一的、专一的、长250bp，含有70%AT的产物。

完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。

补充二：

关于自由能问题（如何根据自由能判断引物质量）

1、ΔG值（自由能）反映了引物与模板结合的强弱程度。

一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。

3′末端双链的ΔG是0～－2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而－10时接近于0。

2、引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG或CCC会导致错误引发。

二聚体形成的能值越高越稳定，越不符合要求。

与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。

虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果，但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与正式反应引物的数量。

当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。

补充三：

关于产物需要测序的PCR引物的设计问题

在DNA测序的PCR中最好用5′末端稳定（如GC含量较多），而3′末端不太稳定（如AT含量较多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。

这就是基于引物内部稳定性的经验之谈。

其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发DNA合成，所以不会产生假产物。

因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。

与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以引发反应，产生非专一产物。

无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。

寡核苷酸3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。

多聚酶亲和指数PPI（polymerasepreferenceindex）是我们最近的一个发明（专利上个月申请进去的）。

PPI的主要用途是提高引物设计的成功率。

我在以前的博客里面讨论过一般设计引物常犯的一个错误：

一般的引物设计软件的“计算”核心公式是计算引物的TM值，用TM值来估算引物和靶基因片段结合的最佳温度。

可是这些计算有三个最根本的缺陷：

（1）TM值的计算公式有多个，同一个引物使用不同的公式会得到很不相同的TM值。

说明TM值的估算很不精确。

（2）TM值的计算一般都需要加入很多相关的修正系数（反应物浓度，例子强度，酶浓度等），而我们在使用公式时通常没有考虑一些关键的系数；

（3）也是最重要的，TM值最多仅能告诉我们引物是否能在（温度）相同的条件下结合到模板上去，可是TM值并不能告诉我们引物是否对酶的亲合性是一样的？

酶对这些引物的使用率是否有差异？

一个成功的PCR反应，需要两个引物同时上到模板上去，还要以相同的效率从不同的方向合成DNA片段。

现有软件的一个最大缺点就是没有去衡量引物和多聚酶的亲合性，不知道贴到模板上去的引物是否被多聚酶所喜欢。

PPI所要试图解决的问题就是引物是否被酶所喜爱的问题。

如何得到这个答案？

前不久，我在写这篇博客的时候，提到过一本介绍多聚酶功能的书，封面就有多聚酶的结构示意图：

在复制DNA的时候，多聚酶所覆盖的核酸大概有10个碱基，六个碱基是双链（有引物结合的），另外四个碱基是即将要合成的模板序列。

所以这10个碱基对核酸合成来说就很重要了。

我们首先假设多聚酶很挑剔，不是所有的引物（和模板）它都喜欢，至少是它对不同的引物喜欢程度不一样。

那么如何知道它到底喜欢那些引物序列呢？

高通量测序给我们提供了一个回答这个问题的机会。

我们到别人实验的“垃圾序列”里面去“淘宝”，找到别人用6个核酸长的随机引物做全基因组扩增然后测序的数据，共四百多万条测序结果。

有了这些测序结果我们就可以计算PPI值了。

计算公式如下：

PPI=A/B*C/D*100.

其中A是测序得到的所有4096种不同的6-mer引物的实际使用频率，B是每个6-mer在扩增产物中的出现频率（代表该6聚体在基因组中的分布频率），A和B的比值就代表了引物被多聚酶使用的频率；

同样，C是测序得到的紧跟引物3'

端，被多聚酶覆盖着的四个碱基的频率（我们起名为“跑道”，好比多聚酶起飞的跑道）,D是测序得到的四聚体在扩增产物中的频率（基因组本底频率），C/D代表“跑道”被多聚酶喜欢的程度。

对一个需要设计引物的靶基因序列来说，如果我们用一个移动的，10个碱基的窗口看这个序列，每是个碱基计算一下它的PPI值，然后把这个值交给第窗口中的第六个碱基，然后把窗口向3'

端移动一个碱基，继续技术PPI.这样就能产生出下面的这个图：

图中绿线和红线分别代表正反两条DNA链上的PPI值。

一些峰值代表多聚酶比较喜欢的序列，或者说是比较适合作为引物的序列。

横线代表引物的位置。

最好是把引物的3’端放在PPI的峰值处，这样该引物的成功几率就会高些。

而且，最好是一对引物具有相差不多的PPI值。

PPI可以帮助给引物定位，然后再通过调整引物的长度的办法来达到相同或者相似的TM值。

iCubate2.0软件在做引物设计时，综合考虑了PPI,TM,和arm-PCR（另外有博文描述）等重要因素。

所以是多重PCR设计不可缺少的工具。

即便是把含有PPI技术的软件放到网上让大家免费使用，我们还是为PPI技术去申请了专利保护。

申请专利不都是为了赚钱，更重要的功能是使自己对一个技术有使用权（freedomtooperate），支配权。

iCubate2.0开放平台的关键一环就是网上的免费多重PCR试剂设计软件。

进入开放平台首页（开发中，还没有开通），首先会看到这个页面：

页面上面给iCubate2.0开放平台上面的试剂（iC）做了一个定义：

iC,就是用多聚酶亲和指数多聚酶亲和指数（PPI,polymerasepreferenceindex）程序,arm-PCR（ampliconrescuedmultiplexPCR）原理设计出的，在iCubate技术平台上使用的多重PCR试剂。

页面下面有三个供选择的区域：

iC建筑师，iC网店，和iC社区。

在iC建筑师区域设计，改造试剂；

在网店进行iC的买卖；

在iC社区学习，讨论，交流和获取商机。

这篇博客主要介绍iC建筑师。

如果还不是注册试剂开发者，首先要注册获取帐号：

建立帐号的主要目的是建立开发者自己的，有密码保护的专用区域，这样才能对开发的内容保密。

每个开发者所开发的所有试剂都有一个特定的帐号记录，今后这个试剂的特定帐号会放到卡盒的二维条码上，这样iCubate仪器才能知道用什么程序，如何做结果分析，如何展示iC特异性的结果。

如果已经是注册开发者了，就通过这个页面可以直接签入iCArchitect区域：

进入iC建筑师区域以后，首先要做的是给出对iC的一般介绍：

首先要给你的iC取个名字，这个名字是要放到iC网店上去的，所以要简练，明了。

其次要对您所开发的试剂做一个简单的介绍：

试剂的用途是什么？

标本是什么样的？

（血液？

呼吸道标本？

还是提取好的核酸？

）你设计的iC要同时扩增多少个靶点？

是否需要检测点突变？

注意，这里介绍试剂的应用范围等的内容要好好考虑，因为这是将来要放到网店中的卖你的产品的最佳“广告”。

接下来会看到这个网页：

根据上页里面填的靶点数，这里列出相应栏目，需要收集靶点相关的信息：

首先是靶点的名称（比如流感病毒H1基因）。

靶点名称很重要，它决定展示结果时的基本单位（比如，流感H1阳性）。

其次，软件需要知道针对这个靶点，开发者要设计几个amplicon（扩增产物）。

虽然对绝大多数多重PCR诊断试剂来说，最终产物里面一般一个靶点有一个扩增产物就够了，但是在开发阶段，为了节省时间（不是反复试那个amplicon更敏感，特异性更强）可以做2-3个作为“保险”。

因为引物现在已经很便宜了，所以可以这样做。

如果为了省钱（可能需要多花些时间），也可以一个靶基因，一个amplicon。

还有，碰到象SARS,禽流感等对公共卫生危害很大的病原体，本身突变发生频率又很强的，可以考虑在最终产品里面多方几个amplicon，这样即使其中一个靶点发生了突变，其它靶点还可以协助诊断。

接下来是问针对特定的靶点，是否需要检测点突变？

几个点突变？

检测点突变就需要我们设计两个PrimerExtension的引物，一个是野生型特异性的，另一个是突变型特异性的，然后用universalarray上面的两个点的信号强度比来决定标本是否有突变。

如果你的靶点不含有点突变，只要把一段基因序列paste到给出的窗口就可以了。

有些网友来信说不知道如何挑选特异性的靶基因片段。

我们正在开发另外一个软件，（也会放到网上供大家免费使用）只要给出一个病原体的基因组序号（GenBank里面的序号）软件就自动挑出该基因组最具特异性的基因片段来。

根据我的经验，如果想找特异性的扩增靶点，最快的方法就是google.比如找流感病毒的PCR靶点，就google"

PCR,influenza,diagnosis"

就能发现很多论文描述realtimePCR的引物设计。

把别人设计的靶点扩大一些，他们扩增150碱基，我就去基因组切出五百碱基来作为设计引物的区域。

如果你设计的扩增靶点含有点突变，这个页面就会出来：

这里需要设计者指出点突变在你给出的序列中的位置，野生型的碱基和突变型的碱基分别是什么？

当把所有需要的信息输入后，按键进行多重PCR引物的全自动设计。

电脑就会根据PPI程序和arm-PCR的原理直接计算出引物和探针的位置。

最后的设计结果这个网页会列出明细：

软件会给出每个靶点的每个引物的序列，包括primerextension用的探针的序列。

点击靶点还可以看到一个展示PPI的图。

软件也容许设计者对引物进行微调，向前或向后做些移动。

另外，每个靶点可能都有机套设计方案，如果首选方案不够理想，日后还可以选择其它引物组合。

如果（在美国）从和我们合作的引物合成厂家订购引物，第一批引物是免费的。

这样研发的起始费用就更加低了。

有关PPI和arm-PCR专利技术的详细介绍我会另外写博客披露的。

从这个软件的流程大家可以看出，设计一个多重PCR的试剂实际很方便，有些经验的人大概不用一个小时就能完成了。

虽然我们会在开发者注册时让用户签一个使用协议，说该软件（和其包涵的PPI，arm-PCR等专利技术）仅供那些开发iCubate技术平台专有试剂的人使用。

我也知道一定有人会违约用这个软件开发多重PCR试剂然后用其它检测平台。

如果那样会有几个致命的局限：

（1）首先该用户就不能享受到全自动，全封闭的iCubate技术平台的好处，实验室污染迟早会发生。

（2）而且，研发出的“产品”不能享用iCStore的国际化销售平台。

（3）没有全自动和全封闭，产品进入市场难，报批难，使用范围毕竟受限。

（4）如果不用iCubate平台，我们优化好的反应条件并没有公开，只有iCubateProcessor根据卡盒上面的二维条码来给出最佳反应条件（PCR的扩增条件，arm-PCR的一些技术参数）,所以多重扩增的成功率没有办法保障。

所以，如果不用iCubate平台，占个小便宜，最后吃的是大亏。

类似的软件使用协议都是防君子不防小人的，目的主要是保护技术开发者，试剂开发者。

开放平台的前提就是大家共同获利。

我们尽最大的努力把平台做得更好，更方便，更便宜。

也希望用户能珍惜这个机会，维护，共建这个平台。

春节过后，我们会在国内几个大城市举办一系列的培训班（北京，上海，深圳，南京，广州，济南，武汉，成都等地），感兴趣参与多重PCR试剂开发的请关注这个博客，最新消息会在这里发布的。