食品微生物的检测技术进展Word文件下载.docx

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检测技术

1.前言

随着人们生活水平的不断提高，食品安全问题逐渐成为各国政府、公众关注的焦点问题。

在众多食品安全相关项目中，微生物及其产生的各类毒素引发的污染备受重视，微生物污染造成的食源性疾病仍是世界食品安全中最突出的问题。

加工食品所含菌的种类、数量，常随原料的生产环境及细菌学质量、工厂环境与包装工程的卫生及处理状况、制品贮运状况等而异。

食品达到细菌学的卫生条件是最终制品中不允许存在致病菌，如果存在食物中毒菌，必须达到不损害人体健康的安全水平。

由于食品微生物污染的广泛发生，严重影响人民的健康，因此食品微生物检验工作对评价食品卫生质量，保证消费者饮食卫生有着极为重要的作用。

研究灵敏度更高、特异性更强、简便快捷的食品安全检测技术和方法，建立和完善食品安全微生物检测技术和体系迫在眉睫。

在各种食品生产加工单位均设有化验室，开展食品微生物检验工作。

在食品质量监测部门，为了监督监测食品生产销售单位的食品卫生质量，也都设有专门的微生物检验室，开展食品微生物检验工作，以及对食品微生物污染的检测和调查研究工作。

2食品微生物检验的内容和特点

2.1概述

食品微生物检验主要是指细菌学检验，包括细菌总数、大肠菌群和致病菌的检验。

经典的方法有固体培养基法（用于细菌总数的检验），液体培养基发酵法（用于大肠菌群的检验），由于设备简单，适用范围广，因此是最为常用的检验法。

而操作简便、快捷的膜分离培养技术在食品微生物检验中也有发展景。

经典的食品微生物检测技术耗时长、效率低、敏感性差，不能及时检出食品中的病原菌。

发展迅速、准确、高效的现代食品微生物检测技术，可以快速检出食品中的病原微生物，迅速对食品卫生质量作出评价，防止食物中毒的发生，有效地控制食源性疾病。

现代食品微生物技术研究内容主要有食源性病原菌免疫学快速检测、食源性病原菌分子生物学快速检测技术、基于培养基生理生化特征的检测技术、食源性病菌的自动化检测技术、食源性致病菌生物传感器检测技术等。

2.2食品微生物检验的特点

食品微生物检验的特点归结为以下5点。

（1）食品微生物检验涉及的微生物范围广，种属多，采集食品微生物检验样品比较复杂，要求高。

（2）食品微生物检验需要一定的准确性与快速性。

（3）食品中待分离细菌数量少、杂菌量多，对检验工作干扰严重。

（4）食品中微生物检验具有数量观念。

（5）食品微生物检验具有一定法律性质。

3食品微生物检验的发展动向

食品卫生微生物鉴定的传统方法有：

形态结构、细胞培养、生化试验、血清学分型、噬菌体分型、毒性试验及血清试管凝聚试验等。

近年来，随着分子生物学和微电子技术的飞速发展，快速、准确、特异检验微生物的新技术、新方法不断涌现，微生物检验技术由培养水平向分子水平迈进，并向仪器化、自动化、标准化方向发展，提高了食品微生物检验工作的高效性、准确性和可靠性。

食品微生物检验新技术有以下几种。

3.1代谢学技术

3.1.1电阻抗法

电阻抗法是近年发展起来的一项生物学技术，已经开始应用于食品微生物的检验。

其原理是细菌在培养基内生长繁殖的过程中，将会使培养基中的大分子电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等，代谢为具有电活性的小分子物质，如乳酸盐、醋酸盐等，这些离子态物质能增加培养基的导电性，使培养基的阻抗发生变化，通过检测培养基的电阻抗变化情况，判定细菌在培养基中的生长繁殖特性，即可检测出相应的细菌。

该法目前已经用于细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的检测。

3.1.2快速酶触反应及代谢产物的检测

快速酶触反应是根据细菌在生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，根据酶的特性，选用相应的底物和指示剂，反应的测定结果有助于细菌快速诊断，如美国3MPetfifilmTM微生物测试片可分别快速测定细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠菌群等。

3.1.3微量生化法

Bachman和Weaver在20世纪40年代后期首先开创了微量生化法的纪元。

随着人们对细菌进行快速生化特性的需求增加，使高精密度（90％）和高重现性的商业试剂盒得以快速发展。

至今，市售的微生物鉴定用试剂盒有多种，常见的有MICRO-ID、API等。

API由20个含干燥培养基的微管组成，其中的培养基用于进行酶促反应或糖发酵试验。

检验时将预处理的菌悬液加入微管中培养后观察颜色变化，并纪录，输入APILABPlus软件得出结果。

API创建了独特的数值鉴定法，可鉴定15个系列、600多个细菌种，因此具有简单、可靠等特点。

3.2　抗体技术

抗体技术中常见是酶联免疫吸附法，是一种测定抗原抗体的有效方法。

原理是将抗体包被聚苯乙烯孔，从而获得抗原，在此过程中需要借助第三种载体，即用事先与酶结合的抗体去接触抗原，从而形成抗体抗原的复合物。

再借助生色酶底物，通过判断复合物颜色的变化来记录检测结果，在操作中只需要通过肉眼观察，就可以判断菌落数量的多少。

抗体方法在食品微生物检验中应用广，根据检测技术的不同又可分为两类。

3.2.1乳胶凝集反应

这利用抗原与抗体特异性结合的特性，加上人工大分子的乳胶颗粒而发生肉眼可见的凝集反应。

AureusTest用于食品样品中金黄色葡萄球菌的检测，该试剂盒中含有对免疫抗蛋白AIgG和鞭毛蛋白敏感的聚苯乙烯乳胶粒子，因细菌蛋白A和IgG结合，凝聚酶和鞭毛抗原结合，所以当含有金黄色葡萄球菌的样品悬浮液加入含乳胶粒子的试剂盒中时，1min内将产生凝集反应。

该法的灵敏度和特异性均较高。

3.2.2酶联免疫吸附法

这是用于定性或定量测定特异抗原抗体的一种技术，它多采用“夹心式”设计，即用抗体包被的聚苯乙烯孔捕获抗原，用另一个结合了酶的抗体与抗原结合形成抗原抗体复合物，再用一种生色酶底物通过肉眼观察或比色法记录结果。

随着单克隆抗体酶联免疫技术的出现，免疫检测法的特异性明显的提高。

3.3分子生物学技术

核酸探针技术在分子生物学技术中的应用十分广泛，需要借助一系列的生物知识，原理是用核苷酸形成杂交双链，进而判定杂交链中的DNA。

在检测过程中，其中一条链子的核苷酸序列号是已知的，即工作人员事先已经知道一条链子的DNA，实验中需要用到基因探针。

在检测中，由于核苷酸中的成分含量有着很大的差异，可以分为两种探针。

一种探针能够分辨出一部分的DNA反应，即对某些菌落敏感，对另外的菌落不敏感；

另一种探针能够分别出全部的DNA反应。

该种检测技术的优势在于菌落微生物对于外界条件比较敏感，所以很容易区分。

但是，其不足在于要求探针对检测时间的精准度把握十分准确，否则容易错过最佳检测时间，影响试验的准确性。

3.3.1核酸探针技术

将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA样品中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子核酸探针或基因探针。

根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分成DNA探针或RNA探针；

根据选用基因的不同分成两种，一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性；

另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。

核酸探针检测技术的最大优点是：

①特异性；

②敏感性。

但探针检测技术中也存在一定的问题，如检测一种菌就需要制备一种探针；

要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养；

探针检测是分析基因序列，对毒素污染的食品有时因样品中不含产毒菌而无法检测。

3.3.2PCR技术

PCR（Po1ymeraseChaninReaction）是多聚酶链式反应的简称，PCR技术是由Kleppe等人在1971年首先提出的。

该方法通过对人工难以培养的微生物相应DNA片段的扩增,检测扩增产物含量,从而快速地对食品中致病菌含量进行检测。

检测时,首先在高温下（95℃）使得蛋白质变性,DNA双链变成单链；

再迅速降温（55℃）,每条DNA单链退火,这就是所谓的热循环。

之后温度重新上升到95℃,开始新的循环。

经一套扩增循环（21到31次）将1个单分子DNA扩增到107分子。

整个过程可以在1h内通过自动热量循环器完成。

理论上,只要样中含有一分子沙门氏菌的DNA,通过PCR技术完全可以在短时间内检测到。

这种测定方法的优点是测定结果迅速、灵敏度和特异性高、检测成本低；

但其存在的最大问题在于PCR产品的污染。

PCR技术采用DNA扩增和自动化程序对特定的致病菌进行检测，已经成功地对沙门氏菌、大肠杆菌O157:

H7、产单核细胞李斯特菌等致病菌进行了有效测定。

实时定量技术是近年来发展起来的新技术，这种方法既保持了PCR技术灵敏、快速的特点，又克服了以往PCR技术中存在的假阳性污染和不能进行准确定量的缺点。

另外，还有重复性好、省力、低费用等优点。

实时定量PCR技术是从传统PCR技术发展而来，其基本原理相同，但定量技术原理不同。

实时定量技术应用了荧光染料和探针来保证扩增的特异性，并且荧光信号的强弱同扩增产物的量成正比，从而准确定量。

该技术在基因突变的检测、基因表达的研究、微生物的检测、转基因食品的检测等领域均有重要的应用价值。

3.4仪器法

随着微生物快速检测法的不断发展,很多检验技术日趋成熟和完善,并被人们进一步开发、研制成自动或半自动微生物检测仪

3.4.1旋转平板技术和激光菌落扫描仪

自动旋转平板技术是在琼脂培养基表面倒一薄层样品,该仪器可使液体样品以螺旋转动方式分布,液体慢速流出后,随着平板的旋转从中心向边缘分布,样品分布非常均匀。

这种方法可广泛用于细菌、酵母、霉菌及乳类样品中。

样品倒入平板后,菌落数可以用激光菌落计数器来计数,即将光检测仪放置在仪器的底部,激光仪从上面自动扫描平板,当激光束通过菌落时,可以降低光的强度,从而检测出菌落的存在。

这样菌落数可以通过电子计数,从而不是传统的视觉计数。

电子计数快而准确,与传统计数法得到的结果相近。

3.4.2流式细胞术（FCM）

该技术是用流式细胞仪对细胞悬液进行自动快速定量分析和分选的新技术,具有速快、精确度高、记数细胞量大以及参数分析等全面测量细胞和分选细胞等优点。

由于FCM检测到的荧光强度的强弱与DNA片段的大小成比例,根据荧光浓度的直方图就可知道细菌的DNA指纹图谱,从而确定细菌的种类。

现在该技术已经能够检测纯化的DNA可达pg级水平,在10min内可以完成数据的收集和分析。

近年来在临床实验室已经逐步用于病毒、细菌的检测、计数、鉴定等。

3.4.3电阻电导检测器

原理是当细菌生产繁殖时,将蛋白质、糖类等大分子物质分解成氨基酸、有机酸等带电荷的小分子物质,改变培养液的导电度,这样,测量电阻和导电度的变化,就可推算出样品原来的含菌数。

Bactometer是利用电阻抗,电容抗或总阻抗等三种参数的自动微生物监测系统,它能快速测定样品中细菌的污染程度,从而快速提供品质控制的信息。

另外,该仪器能通过测定代谢物产生的速度将菌体的数量与其活动相结合,使检验结果达到预测保藏质量和卫生安全的作用。

4食品微生物检测过程中的注意事项

在食品微生物的检测过程中，对于检验的试验性要求很高，主要包括下列内容：

工作人员在操作过程中必须是在无菌的环境中规范操作，检测设备必须达到相应的检测标准，器械的反映灵敏程度高；

各个器皿的温度必须保持一致性；

试验药品在使用之前需要经过高温消毒。

只有这样，才能够确保检验过程的准确性，才能够真正为人们提供正确的数据，为人们的安全保驾护航

5小结

随着食品安全受到的关注越来越多，食品微生物的检测环节得到越多人的重视。

其数据不仅能够为食品安全部门提供相关依据，同时也有利于人们选择更加安全的日常生活必需品，增加人们的放心度。

在科技的发展下，相信食品微生物终将对人们的生活产生更加深远的影响。

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