高考生物总复习第12单元第42讲微生物的培养与应用学案.docx
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高考生物总复习第12单元第42讲微生物的培养与应用学案
第42讲微生物的培养与应用
[考纲点击] 1.微生物的分离和培养 2.培养基对微生物的选择作用 3.利用微生物发酵来生产特定的产物
一、微生物的实验室培养
1．培养基
（1）概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
（2）营养构成：
一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。
此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
（3）种类：
按照物理性质可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基。
2．无菌技术[连一连]
3．大肠杆菌的纯化培养
（1）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
配制步骤：
计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
（2）纯化大肠杆菌
①纯化大肠杆菌，其关键的步骤是接种。
②纯化培养方法：
平板划线法和稀释涂布平板法。
③纯化培养原理：
在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。
二、土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
1．分离原理
土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起催化作用。
以尿素为唯一氮源的培养基能促进分解尿素的细菌的生长和繁殖，并抑制或阻止其他微生物的生长，从而将目的菌分离。
2．统计菌落数目
统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。
3．实验流程
土壤取样→制备培养基→微生物的培养与观察→细菌的计数。
三、分解纤维素的微生物的分离
1．纤维素酶
（1）组成：
纤维素酶是一种复合酶，它包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。
（2）作用
2．菌种筛选
（1）方法：
刚果红染色法。
（2）原理
即：
使用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
3．筛选流程
土壤取样：
富含纤维素的环境
↓
选择培养：
用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的数量
↓
梯度稀释
↓
涂布平板：
将样品涂布于含CR的鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
挑选产生透明圈的菌落：
产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈
1．培养基
（1）培养基的概念：
人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
（2）培养基的营养成分：
培养基可为微生物提供碳源、氮源、无机盐和水等主要营养物质。
2．无菌技术
（1）措施：
无菌技术的主要措施包括消毒和灭菌。
（2）常用方法：
培养基灭菌常采用高压蒸汽灭菌法，接种环灭菌常采用灼烧灭菌法。
3．微生物的纯化与计数
（1）纯化微生物的方法：
常用平板划线法和稀释涂布平板法。
（2）微生物的计数方法：
常用显微计数法和稀释涂布平板法。
4．微生物的筛选
（1）尿素分解菌的筛选：
以尿素为唯一氮源的选择培养基可以筛选分解尿素的细菌。
（2）尿素分解菌的鉴别：
在以尿素为唯一氮源的选择培养基中添加酚红，指示剂可以鉴别分解尿素的细菌。
（3）纤维素分解菌的筛选：
利用富含纤维素的选择培养基可以选择培养分解纤维素的微生物。
（4）纤维素分解菌的鉴别：
在富含纤维素的培养基中添加刚果红，可以从周围存在不变红的透明圈的菌落中挑选分解纤维素的微生物。
考法一 培养基及微生物的纯化培养技术
1．培养基的种类
（1）按物理状态分类
培养基种类
特点
用途
液体培养基
不加凝固剂
工业生产
固体培养基
加凝固剂（如琼脂）
微生物分离、鉴定，活菌计数，菌种保藏
（2）按功能分类
种类
制备方法
原理
用途
举例
选择
培养基
培养基中加入某些化学物质
依据某些微生物对某些物质的特殊需求或抗性而设计
从众多微生物中分离所需的微生物
加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌
鉴别
培养基
培养基中加入某种指示剂或化学药品
产生特定的颜色或其他变化
鉴别不同种类的微生物
用伊红—美蓝培养基鉴别大肠杆菌
2．消毒和灭菌的比较
项目
条件
结果
常用方法
应用范围
消毒
较为温和的物理或化学方法
仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物
煮沸消毒法
日常用品
巴氏消毒法
不耐高温的液体
化学药剂消毒法
用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源
灭菌
强烈的理化因素
杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子
灼烧灭菌法
接种工具
干热灭菌法
玻璃器皿、金属工具
高压蒸汽
灭菌法
培养基及容器的灭菌
3.纯化微生物的接种方法
项目
平板划线法
稀释涂布平板法
原理
通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基上。
在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落
优点
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
可以计数，可以观察菌落特征
缺点
不能计数
吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
适用
范围
适用于好氧菌
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
4．平板划线操作的注意事项
（1）操作第一步即取菌种之前及每次划线之前都需要进行火焰灼烧灭菌，划线操作结束时，仍需灼烧接种环，每次灼烧目的如下表：
第一次操作
每次划线之前
划线结束
目的
杀死接种环上原有的微生物
杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少
杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
（2）灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
（3）第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
（4）划线时最后一区不要与第一区相连。
（5）划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
视角1► 以基础判断或案例分析的形式，考查培养基的制备与无菌操作
1．（表格信息类）下列培养基配方中能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是（ ）
原料
①
②
③
④
蛋白胨/g
10
10
10
10
乳糖/g
5
5
5
5
蔗糖/g
5
5
5
5
KH2PO4/g
2
2
2
2
伊红/g
0.4
美蓝/g
0.065
琼脂/g
10
20
NaCl/g
20
蒸馏水/mL
1000
1000
1000
1000
A．①③ B．②①
C．②④D．③①
解析：
选D。
在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌，有伊红和美蓝的培养基为鉴别培养基。
高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可以将金黄色葡萄球菌分离出来，有高浓度食盐的培养基为选择培养基。
2．（原理判断类）不同的微生物对营养物质的需要各不相同。
下列有关一种以CO2为唯一碳源的自养微生物营养的描述，不正确的是（ ）
A．氮源物质为该微生物提供必要的氮素
B．碳源物质也是该微生物的能源物质
C．无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
D．水是该微生物的营养要素之一
解析：
选B。
碳源分为有机碳源和无机碳源。
当有机物作为碳源时，既是碳源，又可作为能源；当无机物作为碳源时，只能作为碳源，不能作为能源。
该碳源是二氧化碳，属于无机物，不能作为微生物的能源物质。
视角2► 以案例分析的形式，考查微生物纯化培养的综合应用
3．（原理判断类）（2016·北京东城区检测）下列有关微生物实验的叙述，不正确的是（ ）
A．获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染
B．平板划线法可用于微生物的计数
C．分离不同的微生物要采用不同的稀释度
D．观察菌落的特征可以用来进行菌种的鉴定
解析：
选B。
微生物培养过程中要进行无菌操作，防止外来杂菌的入侵，以获得纯净的培养物，A正确；平板划线法可用于微生物的分离，B错误；土壤中各类微生物的种群数量是不同的，稀释的目的是为了使每个微生物个体充分分离，以便在平板培养时能得到由单个微生物个体生长而来的菌落，因此分离不同的微生物要采用不同的稀释度，C正确；每一种微生物在一定条件下形成固定的菌落特征，因此观察菌落的特征可以用来进行菌种的鉴定，D正确。
4．（实验过程图解类）（2016·湖北武汉模拟）有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境，研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。
分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示：
图甲
图乙
（1）微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、______________四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其原因是____________________________________________________________。
（2）与微生物培养基相比，植物组织培养的培养基常需添加生长素和____________，这些植物激素一般需要事先单独配制成________保存备用。
（3）纯化菌株时，通常使用的划线工具是________。
划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。
造成划线无菌落可能的操作失误有________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
（4）为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示实验。
该实验的假设是________________________________________________，该实验设计是否合理？
为什么？
________________________________________________________________________。
解析：
（1）基本培养基必须具有水、碳源、氮源和无机盐，故应填写氮源和无机盐。
在培养基中以苯磺隆为唯一碳源，所以培养基上只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁殖，因此起到选择作用。
（2）植物组织培养基除了营养物质外通常还需要添加植物激素，如细胞分裂素和生长素。
因为植物激素量很少，所以通常配制成母液。
（3）纯化菌种通常用稀释涂布平板法和平板划线法，在平板划线法中用到的划线工具是接种环。
如果划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，这说明有菌种，而第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落，可能的原因有接种环灼烧后未冷却或划线未从第一区域末端开始。
（4）由图可知取了上清液后加入的是蛋白酶溶液，根据酶的专一性，蛋白酶能将蛋白质分解，故应假设的是目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质，如果不能降解苯磺隆说明是蛋白质。
但该实验不严谨，要证明该假设还应该设置一组不加蛋白酶溶液的空白对照。
答案：
（1）氮源和无机盐 只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁殖
（2）细胞分裂素 母液
（3）接种环 ①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始
（4）目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质 不合理，缺少空白对照
考法二 微生物的分离与计数法
1．筛选菌株
（1）原则：
人为提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
（2）菌株筛选原理的比较
土壤中分解尿
素的细菌
分解纤维素的微生物
选择培养基的成分
尿素作为唯一的氮源
纤维素作为唯一的碳源
鉴定方法
在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，pH升高，说明细菌能分解尿素
刚果红染色法，即刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈
2．几种典型微生物的筛选方法
（1）培养基中加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。
（2）培养基中加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。
（3）培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物。
（4）当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。
如当石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。
（5）改变微生物的培养条件，也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养，只能得到耐高温的微生物。
3．统计菌落数目的方法
（1）显微镜直接计数法
①原理：
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
②方法：
用计数板计数。
③缺点：
不能区分死菌与活菌。
（2）间接计数法（活菌计数法）
①原理：
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：
每克样品中的菌株数＝（C÷V）×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（mL），M代表稀释倍数。
③操作：
设置重复组，增强实验的说服力与准确性。
同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
视角1► 以基础判断或案例分析的形式，考查微生物的分离、鉴定与计数
1．（实验流程图类）（2016·江苏泰州高三联考）科研人员从被石油污染的土壤中分离获得能降解石油成分“多环芳烃菲”的菌株Q，步骤如下图所示，下列相关的叙述中，错误的是（ ）
A．步骤①～③中，培养液中需加入多环芳烃菲作为唯一碳源
B．步骤①～③中，将锥形瓶放在摇床上充分振荡，使菌株与培养液充分接触
C．步骤④是利用平板划线法纯化菌株Q，图中所示接种环最少灼烧2次
D．步骤④中每一区域可重复画几次，但1区和5区不能出现交叉
解析：
选C。
要想分离出能降解石油成分“多环芳烃菲”的菌株Q，所用培养液中需加入多环芳烃菲作为唯一碳源，A正确；培养过程中，将锥形瓶充分振荡，目的是使菌株与培养液充分接触，B正确；接种环在每次接种前和接种结束后都要通过灼烧来灭菌，所以完成步骤④中5次划线操作前都要灼烧灭菌，接种结束后还需灼烧灭菌1次，防止造成污染，由此可见，完成步骤④共需灼烧接种环6次，C错误；纯化菌株Q过程中，由于线条末端细菌的数目比线条起始处要少，所以在做第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线，1区和5区不能交叉，D正确。
2．（实验分析类）（2016·山东烟台诊断测试）尿素是一种重要的农业肥料，但是不经过细菌的分解，就不能更好地被植物利用。
生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌（目的菌），培养基成分如下表所示，实验步骤如图所示，请回答下列问题：
KH2PO4
1.4g
Na2HPO4
2.1g
MgSO4·7H2O
0.2g
葡萄糖
10g
尿素
1g
琼脂
15g
将上述物质溶解后，用自来水定容到1000mL
（1）此培养基能否用于植物组织培养？
________，理由是
________________________________________________________________________。
（2）培养基中氮源是________，这种培养基在功能上属于________培养基，目的是只允许能合成________的微生物生长，其他微生物均不能生长。
（3）欲从土壤中分离获取上述特定微生物，可采用__________________________________法进行接种。
（4）在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________________________________________________________________________，
使指示剂变红色，而筛选纤维素分解菌的方法是__________________法。
解析：
（1）由于植物组织培养过程必须添加植物激素，故该培养基不能用作植物组织培养。
（2）分析表格中信息，培养基成分中含有氮元素的物质是尿素；由于尿素为唯一氮源，可以筛选分解尿素的细菌，这种培养基属于选择培养基；由于脲酶能促进尿素的水解，因此分解尿素的细菌能够合成脲酶。
（3）分离微生物常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。
（4）由于尿素分解后产生氨，可使培养基显碱性，从而使酚红指示剂变红；由于纤维素能被刚果红染成红色，因此培养基中加入刚果红可以鉴定分解纤维素的细菌。
答案：
（1）不能 缺少植物激素
（2）尿素 选择 脲酶
（3）稀释涂布平板法或平板划线
（4）酚红指示剂 刚果红染色
视角2► 以案例分析的形式，考查富集培养分离微生物
3．（实验分析类）（2016·北京大兴月考）下图表示从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。
下列与该实验相关内容的叙述中，不正确的是（ ）
A．实验中所用的培养基①②③④均属于选择培养基
B．图中Ⅰ、Ⅱ过程实现了对目标微生物的稀释
C．统计⑤处培养基中的菌落数并不一定代表接种到④上的活菌数
D．在⑤处培养基上形成菌落的微生物同化作用类型为异养型
解析：
选B。
从混合物中分离某种微生物要用选择培养基，利用该分离对象对某一营养物质有“嗜好”的原理，专门在培养基中加入该营养物质，从而使其成为一种“加富”培养基，可使该微生物大量繁殖，在数量上超过原来占优势的微生物，以达到富集培养的目的，用于“加富”的一些物质主要是一些特殊的碳源和氮源，A正确；图中Ⅰ、Ⅱ过程目的是增加目标微生物的数量，B错误；由于一个菌落可能不是由1个细菌，而是由2个或更多个细菌形成，故统计⑤处培养基中的菌落数并不一定代表接种到④上的活菌数，C正确；在⑤处培养基上形成菌落的微生物是以对羟基苯甲酸作为碳源，故其同化作用类型为异养型，D正确。
4．（实验过程图类）饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，还影响对其他营养物质的利用。
若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以吸收利用的磷酸盐等。
以下是科研人员从作物根部土壤中分离产植酸酶的菌株的过程示意图。
请分析回答下列问题：
（1）培养基中除了添加植酸钙以外，还应含有________、________、水、无机盐等基本营养物质。
（2）为防止杂菌污染，要对培养基和培养皿等进行________________，而且须将接种后的培养皿呈________状态放置。
（3）接种以前进行的一系列操作，目的是在培养皿表面形成________________。
根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的________就能大致推测出样品中的活菌数。
（4）由于植酸钙的不溶解性，使培养基中形成白色浑浊。
产植酸酶的菌株会水解植酸钙，菌落的周围将形成透明的区域，根据透明区域的有无，可初步判断该菌是否产植酸酶。
实验结果显示A～E五种菌株中，________是产植酸酶的理想菌株。
（5）获得目的菌以后，若要用于植酸酶的生产，还需要进行____________________________。
解析：
（1）微生物生长所需的营养物质一般都含有水、无机盐、碳源、氮源等。
（2）为防止杂菌污染，要对培养基和培养皿进行灭菌处理，而且须将接种后的培养皿呈倒置状态放置，以防止污染。
（3）接种以前对样品进行稀释的目的是在培养皿表面形成单个菌落，根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数就能大致推测出样品中的活菌数。
（4）根据题意，透明圈越大，说明植酸酶越多，故E是最理想菌株。
（5）获得目的菌后，若用于植酸酶的生产，还需要进行扩大培养。
答案：
（1）碳源 氮源
（2）（高压蒸汽）灭菌 倒置
（3）单个菌落 菌落数
（4）E
（5）扩大培养
易错点1 误认为不同生物需要的营养物质不同
[点拨]
（1）微生物需要的营养成分有水、无机盐、碳源、氮源，有些微生物还需要特殊营养物质，如生长因子。
（2）在人和动物中，营养物质包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、维生素六类。
（3）在植物中，营养物质包括矿质元素、水、二氧化碳三类。
易错点2 进行恒温培养时，不将培养皿倒置
[点拨] 如果正放培养皿，则皿盖上形成的水滴会落入培养基表面并且扩散开。
如果培养皿中已形成菌落，则菌落中的细菌会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。
因此恒温培养时，培养皿必须倒置。
►微观清障
（1）培养基中一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四种成分。
（ ）
（2）将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上分离分解尿素的细菌，是否无菌操作影响较小。
（ ）
（3）培养基分装到培养皿后进行灭菌。
（ ）
（4）从有机废水中分离微生物用于废水处理时，接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养。
（ ）
（5）消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害。
（ ）
（6）（2015·四川卷T3D）用稀释涂布平板法培养计数，应选择有30～300菌落数的平板。
（ ）
（7）土壤中纤维素分解菌的筛选流程中的“选择培养”是必不可少的。
（ ）
（8）在富含纤维素的培养基中加入刚果红染色剂，若出现周围存在透明圈的菌落，则说明筛选到了分解纤维素的微生物。
（ ）
答案：
（1）√
（2）√ （3）× （4）× （5）√ （6）√ （7）× （8）√
1．（2015·高考江苏卷）人工瘤胃模仿了牛羊等反刍动物的胃，可用来发酵处理秸秆，提高秸秆的营养价值。
为了增强发酵效果，研究人员从牛胃中筛选纤维素酶高产菌株，并对其降解纤维素能力进行了研究。
请回答下列问题：
（1）在样品稀释和涂布平板步骤中，下列选项不需要的是________（填序号）。
①酒精灯 ②培养皿 ③显微镜 ④无菌水
（2）在涂布平板时，滴加到培养基表面的菌悬液量不宜过多的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
（3）向试管内分装含琼脂的培养基时，若试管口粘附有培养基，需要用酒精棉球擦净的原因是________________________________________________________________________
____________________。
（4）刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。
研究人员在刚果红培养基平板上，筛到了几株有透明降解圈的菌落（见图）。
图中降解圈大小与纤维素酶的________有关。
图中降解纤维素能力最强的菌株是________（填图中序号）。
（5）研究人员用筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4，在不同温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果见下图，推测菌株________更适合用于人工瘤胃发酵，理由是________________________________________________________________________
___________________
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