OECD 474哺乳动物红细胞微核试验文档格式.docx
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14.每个试验对每种性别都应包括同时进行的阳性对照和阴性（溶剂/赋形剂）对照。
除了受试物染毒之外，对照组动物都应与染毒组动物以相同的方式进行操作。
15.阳性对照组应预期检测到超过本底值的有微核的红细胞频率增加。
应选择阳性对照剂量以得到阳性结果，但并不使读片者立即发现其为阳性对照标本片。
阳性对照的染毒途径可不同于受试物染毒途径，并且可于单个时间点采样。
如可能，可考虑利用与受试物化学结构相关的阳性对照。
阳性对照物的举例包括：
化学物
甲磺酸乙酯（ethylmethanesulphonate）|CAS
no.
62-50-0|
乙基亚硝基脲（ethylnitrosourea）|CAS
759-73-9|
丝裂霉素C（mitomycinC）|CAS
50-07-7|
环磷酰胺（cyclophosphamide）|CAS
50-18-0
（CAS
6055-19-2）|
三亚乙基密胺（triethylenemelamine）|CAS
51-18-3|
16.除非动物间的变异可以接受，并且有微核的红细胞频率的本底性对照资料可以利用，每个采样时间点都应包括仅以溶剂/赋形剂处理的阴性对照，并与染毒组同样的方式处置。
如果阴性对照只用单次采样，则最适采样时间点为首次采样时间。
必要时，也应该有未处理对照，除非本底性对照或已出版的对照资料证明所选用的溶剂无细胞毒性或致突变作用。
17.如采用周围血，染毒前样品也可作为阴性对照，但此仅适用于短期（如1～3次染毒）周围血试验并且其结果应在本底性对照的预期范围中。
操作方法
动物的数量和性别
18.每个染毒组和对照组必须至少包括每种性别5只可分析的动物【11】。
如果有资料证明同一品、系和染毒途径在性别之间无显著差别，则用一种性别也可。
当人类接触于此受试物可能有性别特异性（如某些药物），则应在适当性别的动物进行本试验。
染毒程序
19.可采用多种染毒方案，如1次，2次或多次染毒，间隔24h。
如果为证实阳性结果，或已出现毒性，或应用了限度剂量并染毒持续到采样时，仍为阴性结果，可扩展染毒方案。
20.试验可以2种方式进行：
（a）.以受试物1次染毒动物。
以适当的间隔采集骨髓样品至少2次，开始不早于染毒后24h，最后不晚于染毒后48h。
早于染毒后24h的采样，应说明理由。
周围血采样以适当的间隔至少2次，开始不早于染毒后36h，最后不晚于染毒后72h。
如在一个采样时间发现阳性结果，不需要进一步的采样。
（b）.每天1次染毒，共2次或多次（间隔24h）染毒，可在末次染毒后18~24h之间采集骨髓1次，对周围血可在未次染毒后36h~48h之间采样1次【12】。
21.必要时，可进一步利用其它采样时间。
剂量水平
22.用于确定剂量范围的预试验，应与正式试验相同，在同一实验室，利用同一品系、性别的动物和染毒程序来进行【13】。
如果存在毒性，第一次采样时间点，应有3个剂量水平，覆盖最大毒性至几乎无毒性。
在之后的采样时间点，仅需采用最高剂量。
最高剂量是指产生毒性体征，但不引起死亡的剂量。
对有特异生物学活性的物质（如激素和促细胞分裂剂）可设置较低的无毒性剂量，应逐例评价。
最高剂量也可规定为引起骨髓毒性的剂量（如在骨髓或周围血中嗜多染红细胞比例降低）。
限度试验
23.如果单次染毒剂量水平（或同一天2次处理）至少2000mg/kg体重，不产生可观察到的毒性效应，并且根据结构相关化合物的资料预期受试物无遗传毒性，则不需要进行3个剂量水平的试验。
对染毒期长达14d的较长期试验，剂量限度为2000mg/kg体重，染毒长于14d，剂量限度为1000kg/kg体重。
人预期的暴露量较高时，在限度试验中可能需要用更高的剂量。
染毒
24.受试物通常用灌胃或腹腔注射染毒。
其他合理的染毒途径也可接受。
一次灌胃或注射染毒的最大液体容积应不超过2ml/100g体重。
利用更高容积，必须说明理由。
一般推荐等容积染毒。
骨髓/血液制备
25.处死后立即从股骨或胸骨采集骨髓细胞、制片和染色。
从尾静脉或其它适当的血管采取周围血，血细胞立即在存活状态染色或制备涂片并染色【8】【9】【10】。
为排除人工假象可利用DNA特异性染料（如吖啶橙【14】或Hoechst33258加Pyronin-Y【15】），也可利用纤维素柱去除有核细胞等到方法【16】。
分析
26.应对每个动物的骨髓至少观察200个红细胞，对周围血至少观察1000个红细胞，计数嗜多染红细胞在总红细胞（嗜多染红细胞+嗜正染红细胞）中比例，嗜多染红细胞在总红细胞中比例不应低于对照值的20%【17】。
每个动物至少观察2000个嗜多染红细胞以计数有微核嗜多染红细胞频率。
计数嗜正染红细胞微核可能得到更多的信息。
当动物连续染毒4周或更长时，每个动物至少计数2000个嗜正染红细胞的微核发生率。
可利用证明可靠的自动分析系统（图象分析和细胞悬液流式细胞仪）。
资料和报告
数据处理
27.以表格表示各个动物的资料。
试验单位是每只动物，应对每个动物分别列出计数的嗜多染红细胞数、有微核的嗜多染红细胞数、嗜多染红细胞在总红细胞中比例。
如动物连续染毒4周或更长时，对嗜正染红细胞的资料也应给出（如已有）。
如果没有性别差异的证据，数据可合并后作统计学分析。
结果评价和解释
28.判断阳性结果的标准为与剂量相关的有微核的嗜多染红细胞数增加，或在单一采样时间点、单一剂量组有微核的嗜多染红细胞数明显增加。
应首先考虑结果的生物学意义。
统计学方法可以用于评价试验结果【18】【19】。
统计学的显著性不应是确定阳性结果的唯一因素。
可疑的结果应该经进一步试验，最好改变试验条件。
29.结果不符合上述标准的受试物认为在此试验为阴性结果。
30.虽然大多数试验将得到明确的阳性或阴性结果，在少见的情况下，所得到的资料不能对受试物的致突变性进行明确的判断，经多次重复试验，结果仍然是可疑的。
微核试验阳性结果表明此受试物引起试验动物成红细胞染色体损害或有丝分裂装置损害产生微核，阴性结果表明在试验条件下，受试物对试验动物末成熟的红细胞不产生微核。
31.应考虑受试物或其代谢产物到达体循环或靶器官（如系统毒性）的可能性。
试验报告
32.试验报告必须包括下列信息：
（1）受试物：
鉴定资料和CAS编号（如已知）；
理化特性和纯度；
受试物的稳定性（如已知）。
（2）溶剂/赋形剂：
溶剂/赋形剂选择依据；
受试物在溶剂/赋形剂中的溶解性和稳定性（如已知）。
（3）动物：
所用品、系；
动物的数量、鼠龄和性别；
来源、饲养条件、饲料等，在试验开始时动物的个体体重，包括每组的体重范围，均数和标准差。
（4）试验条件：
阳性对照和阴性（溶剂/赋形剂）对照；
关于剂量设置的预试验资料（如进行）；
剂量水平选择的理由；
受试物制备的细节；
染毒程序和方法的细节；
染毒途径的选择理由；
证明受试物到达体循环或靶器官的方法（如进行）；
从饲料/饮水的受试物浓度（ppm）换算成实际剂量（mg/kg体重/d）（如进行）；
饲料和饮水质量；
染毒和采样方案的详细叙述；
测定毒性的方法；
计数有微核嗜多染红细胞的标准；
每个动物分析的细胞数；
判断试验结果为阳性、阴性或可疑的标准。
（5）结果：
毒性体征；
嗜多染红细胞在总红细胞中比例；
每个动物分别给出有微核嗜多染红细胞数；
各组有微核的嗜多染红细胞的均数和标准差；
剂量-反应关系（如可能）；
统计学分析的方法和结果；
同时进行的阴性对照资料；
阴性本底对照资料包括范围、均数和标准差；
同时进行的阳性对照资料。
（6）结果的讨论
（7）结论
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附录
定义
着丝粒[centromere（kinetochore）]：
在细胞分裂期染色体与纺缍体纤维联的区域，以使子染色体有序移动到子细胞两极。
微核（micronuclei）：
由于在有丝分裂（减数分裂）末期迟滞的染色体断片或整条染色体生成的，分离或附属于细胞主核的小核。
嗜正染红细胞（normochromaticerythrocyte）：
成熟的红细胞，其缺乏核糖体并可用选择性核糖体染料与未成熟的嗜多染红细胞区分。
嗜多染红细胞（polychromaticerythrocyte）：
未成熟的红细胞，处于发育的中间期，仍含有核糖体，故可用选择性核糖体染料与成熟的嗜正染红细胞区分。
重要中英文术语对照
着丝粒（centromere）
微核（micronuclei）
嗜正染红细胞（normochromaticerythrocyte）
嗜多红细胞（polychromaticerythrocyte）。
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