复制DNA损伤修复逆转录转录Word格式文档下载.docx

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DNA复制具有高度忠实性

2.DNA聚合酶的特征

DNA聚合酶的底物是dNTP和引物-模板连接处（其中模板指引合成方向，引物提供3`端吸引底物的5`-P形成磷酸二酯键）

DNA聚合酶的活化中心催化DNA合成（DNA聚合酶具有监控进入的dNTP形成A：

T或者G：

C配对的能力，还能区分rNTP和dNTP）

3.DNA聚合酶的分类

●原核生物的DNA聚合酶分别有DNA-polⅠ，DNA-polⅡ，DNA-polⅢ，而且他们都有3`-5`核酸外切酶的活性。

DNA-polⅠ

DNA-polⅡ

DNA-polⅢ

分子量（kd）

108

120

250

组成

单肽链

还不清楚

多亚基不对称二聚体

分子数

400

？

20

5`-3`核酸外切酶

有

无

基因突变后的致死性

可能

不可能

其中，

1.DNA-polⅢ是复制中真正起催化作用的酶，由a，ε，θ组成核心酶，两边的β起夹稳模板链并使酶沿模板滑动的作用。

由六个亚基构成y-复合物，负责将可沿DNA链滑动的一对β-亚基加载于DNA上，使DNA聚合酶三具有持续合成能力。

2.DNA-polⅠ的二级结构以a-螺旋为主，可划分为A到R共18个a-螺旋，其中I到O容纳DNA链，H到I是无结构的氨基酸残基，把DNA链包裹起来，使其向一个方向滑动。

但是，DNA-polⅠ的主要作用是对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行修补。

3.DNA-polⅡ基因发生突变，细菌仍能存活，推想他是其他两种酶缺失情况下暂时其作用的酶。

●真核生物的DNA聚合酶至少有15种，但常见的有5种，都有5`-3`核酸外切酶的活性。

DNA-pol

a

β

y

δ

ε

分子量

16.5

4.0

14.0

12.5

25.5

3`-5`核酸外切酶活性

功能

起始引发，引物酶活性

低保真度的复制

线粒体DNA复制

延长子链的主要酶，解螺旋酶活性

填补引物空隙，切除修复，重组

4.复制保真性的酶学依据：

A核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正B复制的保真性依赖聚合酶对碱基的选择功能C靠模板的指引，子链延长严格遵照碱基配对规律。

5.原核生物的DNA生物合成

●复制起始：

DNA解链形成引发体

1.DNA解旋：

解旋的过程主要由DnaA，B，C三种蛋白共同参与。

有相同亚基组成的四聚体DnaA辨认并结合与串联重复序列即AT区，然后几个相同的DnaA蛋白结合成类似核小体。

DnaB在DnaC蛋白的协同下，结合和沿解链的方向移动，并且逐步置换出DnaA。

此时，就形成了复制叉。

同时，SSB（单链DNA结合蛋白）在一定时间内使复制叉保持适当的长度，利于核苷酸依据模板参入。

2.引发体和引物：

引物由引物酶催化合成的短链RNA分子。

引发体就是含有解螺旋酶，DnaC蛋白，引物酶和DNA的开始复制区的复合结构。

其作用过程：

引发体的蛋白质组分在DNA链上移动（ATP供能），在适当的位置，引物酶催化生成引物，留有3`-OH末端，此时进入DNA复制延长。

●复制延长的过程，前导链连续复制，后随链不连续复制

1.复制延长是指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或者延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

2.冈崎片段的形成原因，是因为后随链的子链延长方向与解链的方向相仿，需要等待复制叉解开至相当长度，生成新的引物，然后又在引物3`-OH末端上延长。

●复制的终止过程：

切除引物，填补空缺和连接切口

1.多个引物的水解需胞核内的RNA酶，留下的空隙由DNA-polⅢ催化，从5~-3~用dNTP为原料申城相当于引物长度的DNA链。

最后，大缺口又连接酶连接起来。

6.真核生物的DNA生物合成

●真核生物复制的起始与原核基本相似，但是作用的酶类是

A：

DNA-pola合成RNA-DNA引物（首先合成RNA引物，再利用其DNA聚合酶活性将引物延伸，产生起始DNA短序列，形成RNA-DNA引物）

B：

复制蛋白A（RPA）相当于SSB，可促进DNA进一步解旋，一定条件下激活POLa或者引发酶活性

C：

复制因子C（RFC）含5个亚基（其中p140的存在，其ATPase活性才能被PCNA激活），他的主要功能是促使可滑动的DNA夹子PCNA结合于引物-模板链。

D：

增殖细胞核抗原（PCNA）是是可滑动的夹子。

RFC可将PCNA三聚体装载于DNA并可卸载下来。

同时，PCNA是协调DNA复制，DNA损伤修复，表观遗传和细胞周期调控的核心因子。

E：

DNA聚合酶δ合成前导链和后随链。

F：

DNA解旋酶打开双螺旋以暴露复制模板

G：

真核复制叉有一个POLa和2个polδ复合物

●引发和延伸发生DNA聚合酶a\δ转换

1.引发体组装：

识别染色体DNA复制起点和DNA局部解旋后，POLa|引发酶复合物结合于复制起点。

2.引发和延伸发生DNA聚合酶a\δ转换：

其机制为POLa|引发酶产生RNA-DNA引物，接着RPC识别其iDNA的3~端，取代POLa|引发酶，然后PCNA结合DNA并引入POLδ。

POLa被取代的原因是POLa不具有持续合成能力。

●端粒酶参与解决染色体末端复制问题

在染色体末端，有端粒取代引物RNA。

而端粒酶（一种由RNA和蛋白质组成的核糖蛋白RNP）能够延伸其DNA底物的3~端，以自己的RNA组分为模板，以染色体的3~端后随链模板为引物将端粒序列（富含TG的序列）加于染色体的3~端。

●线粒体DNA按D环方式复制；

噬菌体DNA按滚环方式复制。

7.DNA的损伤修复

●原核生物利用错配修复蛋白MutS二聚体沿着DNA运动，去现DAN骨架因非互补碱基对之间的不对称而长生的变形，从而识别错配的核苷酸,结合MutL（在母链上）和MutH（在子链上）将错配的子链部分切除，再由DNA-polⅢ填补，连接酶封口。

●真核细胞修复错配核苷酸利用的是MSH蛋白，以及与MutL同源的和PMS蛋白。

●化学或物理因素造成细胞DNA损伤：

碱基丢失，碱基改变，和泛酸插入或缺失，DNA链断裂，DNA链间共价交联（具有两个功能基团的烷化剂）

●DNA损伤的修复系统有

1.直接修复系统利用没简单的逆转DNA损伤（光复活修复系统，可见光能激活细胞内光裂合酶，将DNA中因紫外线而形成的嘧啶二聚体分解，但哺乳动物缺乏）

2.碱基切除系统修复切除受损碱基（碱基切除修复是最普遍的切除之一。

3.核苷酸切除修复系统识别DNA双螺旋变形。

核苷酸切除修复NER有4种蛋白质组成：

UvrA，UvrB，UvrC和UvrD。

在着色性干皮肤XP患者中，紫外线辐射产生的嘧啶二聚体几乎没有任何改变。

4.重组修复系统能够修复双链短链损伤。

前提是还有一条链保持完整，且可用于修复DNA复制中的差错。

5.跨损伤DNA聚合酶能够跨越损伤部位合成DNA。

8.逆转录

●RNA病毒的基因组是RNA，其复制方式是逆转录。

●逆转录的过程分三步：

首先是逆转录酶以病毒基因组RNA为模板，催化dNTP聚合生成DNA互补链，产物是RNA-DNA杂化链。

然后杂化双链中的RNA被逆转录酶中的RNase活性的组分水解，被感染细胞内的RnaseH也可水解RNA链。

RNA分解后剩下的单链DNA再作为模板，由逆转录酶催化合成第二条DNA互补链。

●逆转录酶的三种活性：

RNA或DNA作模板的dNTP聚合活性和RNase活性，需要锌离子为辅助因子。

●合成方向也是5~-3~

●逆转录病毒在宿主细胞的繁殖：

逆转录成双链cDNA—双链cDNA插入宿主染色体形成原病毒—原病毒DNA转录产生病毒RNA—病毒RNA经翻译和包装形成逆转录病毒颗粒。

9.NRA的生物合成

●原核生物转录的模板和酶

1.能转录出RNA的DNA片段称为结构片段

2.所谓的不对称转录是指A一条链作为模板指引转录，另一条不转录B模板链（DNA双链中按碱基配对规律指引转录生成的RNA单链的DNA链）并非总是在同一单链上。

3.RNA聚合酶，能催化NTP之间形成3~,5~磷酸二酯键合成RNA，还需要镁离子和锌离子辅助。

而且该合成不需要引物，只需要DNA特殊序列—启动子（RNA聚合酶在转录起始上游的结合序列），就能启动RNA合成。

4.RNA聚合酶有多个亚基组成，分别有a2，β，β`，σ和ω组成。

其中a2ββ`（ω）亚基合称为核心酶，加上能够辨认转录起点的σ亚基统称为全酶。

转录起始需要的是全酶，但是转录延长阶段则仅需要核心酶。

其中β`亚基是RNA聚合酶与DNA模板相结合相依附的组分，a亚基决定转录哪些类型和种类的基因。

全酶的前三个亚基都参与整个转录过程。

5.RNA聚合酶结合到DNA的启动子上启动转录

因为转录是不连续，分区进行的，所以每个转录区段可视为一个转录单位称为操纵子，而操纵子包括若干个结构基因及其上游的调控序列。

其中，调控序列中的启动子就是RNA聚合酶结合到模板DNA的部位（控制转录的关键所在）

●原核生物的转录过程

1.转录起始先形成RNA聚合酶全酶，模板和转录5~端首位的四磷酸二核苷（GTP或者ATP）组成的转录起始复合物。

其主要过程是：

由σ因子辨认DNA的启动子-----由RNA聚合酶与之结合----DNA双链打开10-20个碱基对，形成转录空泡----RNA聚合酶按照模板链的序列指引，以NTP为底物进行相应的碱基配对----当最初的两个核苷酸相连在一起时，形成转录起始复合物，同时σ因子脱落，等再次与核心酶结合。

2.转录延长：

σ因子脱落后，核心酶向模板链下游移动，在核心酶的催化下，与DNA模板链互补的NTP逐个聚合到新生的RNA链上，形成核心酶-DNA-RNA转录复合物。

3.转录终止有两种机制：

一是依赖ρ因子的转录终止，其作用机制尚不清楚，他是一种具有6个相同亚基的蛋白质，能和新生成的具有ρ-依赖转录终止区序列RNA作用，并以5~到3~方向移动，移动到转录复合体后，终止转录。

二是不依赖ρ因子的转录终止，其特征为A有几个连续的尿嘧啶B是在这几个连续的U序列之前有一段富含G和C，并有可以自身互补的碱基的序列。

真核生物的转录过程

1.真核生物的转录需要三种酶：

RNA-polⅠⅡⅢ。

其中Ⅰ酶催化和车工45SRNA，对鹅膏藫碱反应耐受。

Ⅱ酶催化合成mRNA前体hnRNA，此酶对鹅膏藫碱反应极敏感。

3酶催化合成5SRNA，tRNA和snRNA，此酶对鹅膏藫碱中度敏感。

其中Ⅱ酶中最大的亚基称为RBP1，末端有一段共有序列，为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Por-Ser的重复序列，称为羧基末端结构域（CTD）

2.转录起始需要启动子，RNA聚合酶和转录因子参与

（1）在转录起始点上游参与转录调控的DNA序列称为顺式作用元件，其包括启动子，启动子上元件和增强子（能结合特异基因调节蛋白，促进邻近或者远隔特定基因表达的DNA序列）等。

在真核生物中，也需要RNA聚合酶对起始区上游DNA序列作辨认和结合，生成起始复合物。

而在上游中的有被称为Hognest盒或TATA盒的共同的TATA序列（启动子的核心序列）。

（2）转录因子：

能直接，间接辨别和结合转录上游区段DNA的蛋白质称为反式作用因子。

而在反式作用因子中，直接或间接结合RNA聚合酶的称为转录因子。

（3）转录起始前复合物是由RNA聚合酶，各种转录因子和转录起始区结合的复合物。

1.转录延长，过程与原核生物大致相似，但是有核膜相隔。

没有转录和翻译的同步现象。

而且转录延长发生在核小体的移位和解聚。

2.转录终止：

在下游，常有一组共同序列AATAAA，再下点就是重复的GT序列，这些序列称为转录终止的修饰点。

在转录经过修饰点时，mRNA被切断，随即加上POLA及5~帽子结构。

●真核生物转录后的修饰（转录生成的RNA只是初级的转录产物，不具有活性）

1.真核生物mRNA的转录后加工（mRNA的前体是hnRNA）

（1）首尾修饰5~末端加帽子：

经过磷酸解，磷酸化和甲基化，使其第一个核苷酸生成7-甲基鸟苷三磷酸鸟苷（帽子结构）。

在尾端，在多聚腺苷酸聚合酶的作用下，在3~末端有ATP聚合形成多聚腺苷酸（尾）

（2）mRNA剪接的过程是切除内含子（断裂基因的非编码序列），连接外显子（断裂基因中的编码序列），此过程需要snRNA参与。

2.tRNA的加工：

包括5~和3~末端多余的核苷酸的切除，内含子的剪接，稀有剪辑的生成和3~末端加上CCA-OH3~序列。

3.rRNA的转录后加工：

rRNA基因纵向串联并重复排列，转录生成的SrRNA要经过剪接，才能成为5.8S,18S，28S三种有功能的rRNA

4.RNA的加工可采用自我剪接的形式，这些rRNA都具有茎环状结构组合成的锤头二级结构，但在某些序列张必须有特定的碱基。