原位杂交步骤自己整理的精讲.docx
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原位杂交步骤自己整理的精讲
荧光原位杂交
试剂及其配制方法（以下试剂均需用
RNase-free水配制）：
1×PBS：
NaCl8g∕L、KCl0.2g∕L、Na2HPO41.44g∕L、KH2PO40.24g∕L，溶于DEPC处理的去离子水中，用pH计测其pH，再用NaOH调其pH为7.4；
PBST：
PBS加0.1%吐温-20；
LiCI：
配4MLiCI100ml需要LiCI．H2025.6g，配好后加入千
分之一的DEPC，37℃，12h放置，高温灭菌。
4%多聚甲醛（4%PFA）：
准确称取40g多聚甲醛，溶于1000ml的1×PBS中，避光于摇床（37℃，160r∕m）上，待其全部溶解后，用棕色瓶分装成小体积包装，保存于－20℃。
（注：
本方法与其他一些文献用NaOH和HCl先后调节pH而促其溶解的方法略有不同，因是考虑到pH的稳定性；另外之所以采用上述方法
使多聚甲醛缓慢溶解而没有采用文献中提及的用NaOH调节
其pH至10促其溶解后再用HCl调节pH的原因，除了用一般的pH试纸测量配置好的4%多聚甲醛的pH不够准确外，
也因为不能用pH计对其酸碱度进行测量，因为它会损坏pH计）。
取以上各成分，溶于DEPC处理过一定量的纯水（或双蒸水）中，测定其pH（放置一段时间待其pH稳定后），据此以HCl或NaOH来调节其pH值至7.4，定容至所要求的体积。
（注：
根据实际情况，因DEPC处理过的水其pH会下降，故
本实验中实际上是用1mol∕L的NaOH来调节其pH）。
75%甲醇／PBST：
将无水甲醇按75%（V／V）比例溶于PBST；50%甲醇／PBST：
将无水甲醇按50%（V／V）比例溶于PBST；25%甲醇／PBST：
将无水甲醇按25%（V／V）比例溶于PBST；
HYB－溶液：
50%甲酰胺（V／V）、5×SSC（终浓度）、0.1%吐温-20（终
浓度）、RNase-free水（－20℃）pH6.2
HYB＋溶液：
HYB－溶液、500ug／ml酵母tRNA、50ug／ml（终浓度）
肝素，（－20℃）；pH6.2
50%甲酰胺／2×SSCT：
50%甲酰胺（V／V），2×SSCT（终浓度）；
2×SSCT：
2×SSCT（终浓度），0.1%吐温-20；
MAB马来酸缓冲液（Maleicacidbuffer）：
100mMmaleicacid，150mM
NaCl，pH7.5（20℃），溶于双蒸水，用浓缩或固体的NaOH调节pH
为7.5，并过滤除菌（sterile）
MABT:
MAB，使用前加入0.1%吐温-20；
10×Blockingreagent（阻断剂）：
将阻断试剂（Blockingreagent）溶于马来酸缓冲液中，摇晃并在加热器或微波炉上加热，使其终浓度为10％（w/v）；此储存液（原液）需高温除菌？
（isautoclaved）并分装后保存于－20℃。
封闭缓冲液（blockingbuffer）：
10%羊血清、2%阻断剂（终浓度），两者溶于MABT；三者MABT:
羊血清：
10%阻断剂=7:
1:
2；也有用：
1×PBT，2%sheepserum（vol/vol），2mg／mlBSA）
1×Blockingreagent：
用马来酸缓冲液将10×Blockingreagent稀释1×Blockingreagent。
此溶
液需要随配随用，不可久放。
标准杂交缓冲液（standardhybridization）：
5×SSC、0.1％N-lauroylsarcosine（w/v），0.02
SDS（w/v），1％Blockingreagent（取1/10体积的10×Blockingreagent）
标准杂交缓冲液（含甲酰胺）：
50%去离子甲酰胺，5×SSC、0.1％N-lauroylsarcosine（w/v）
0.02％SDS（w/v），2％Blockingreagent（取1/5体积的10×Blockingreagent）
％
，
蛋白酶K储液：
10mg／ml；将蛋白酶K按10mg／ml溶于PBT中，
分装成100ul的小包装，保存于－20℃。
使用浓度为10ug／ml（。
注：
PBS不需要除酶，因为蛋白酶K可以降解RNase）
抗地高辛荧光素偶联的抗体（Anti-digoxigenin-fluorescein，Fab
fragments）保存及使用方法：
1、激发最大波长（Excitationmax）:
494nm；发射最大波长（Emission
max）：
523nm
抗体冷冻干粉末，用1ml双蒸水进行溶解，其终浓度为200ug／ml，即200ng／ul。
注意事项：
此保存液应该在使用前不久进行稀释，（Note:
Thestocksolutionshouldbedilutedshortlybeforeuse）；
2、以上保存液在2－8℃避光条件下，可以保存2个月。
保存液应
避免反复冻融，分装后，保存于－20℃
3、推荐使用含0.5%BSA（w／v）的PBS（pH7.4）对以上抗体保存
液进行稀释；
4、此抗体可以用来对地高辛标记的复合物进行检测，注意事项：
在使用抗体之前，10000rpm离心5min，且在液面吸取需要的
体积。
探针的制备过程：
1、设计上下游引物，加酶切位点（HindⅢ、EcoRⅠ）和保护性碱基（3个保护性碱基），用来扩增目的基因片段，回收目的基因片段，然后用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切。
2、用限制性内切酶（HindⅢ、EcoRⅠ）对载体pSPT18（约1ug的量）进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的片段，溶于适量无菌水中。
设计上下游引物，扩目的片段为700～800bp长度的片度，回收连接T-载体，连接过夜，
3、将pSPT18酶切回收后的片段与相应酶切的基因片段，按摩尔
比例1:
10左右进行混合，加入连接酶，16℃，连接过夜。
4、将以上的重组载体进行转化，选择具有氨苄青霉素抗性的培养
基，37℃，培养13-15h，保存于4℃冰箱，再进行挑菌，接种于含1‰氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min条件下，摇菌过夜。
5、次日，用特异性引物做菌落PCR，确定插入目的基因片段重组
成功的克隆，保存菌种，其余进行测序验证。
测序成功
6、选择测序验证成功的相应菌液，进行扩大培养，回收重组质粒。
7、对重组质粒分别进行单酶切（HindⅢ、EcoRⅠ），使其线性化，并回收线性化的质粒DNA，以用于体外转录。
（如何回收较好？
1、Puri?
cationoflinearDNAcanbeachieved
byphenol/chloroformextractionfollowedbyethanol
precipitation.2、）
8、选择插入片段5＇端酶切位点的酶（合成反义RNA）或3＇端酶切点的酶（合成正义RNA）。
对于本实验来说，用RNA聚合酶T7，
对HindⅢ酶切的模板DNA进行体外转录，以产生可以检测
CXCR7基因mRNA的反义RNA探针；用RNA聚合酶SP6，对EcoRⅠ酶切的模板DNA进行体外转录，产生用于阴性对照的正义RNA探针。
反应体系为20ul,所加模板DNA为1ug左右，10×NTP
labelingmixture2ul
、10×Transcriptionbuffer2ul
、
ProtectorRNaseinhibitor1ul
、RNAPolymeraseSP6
or
RNAPolymeraseT72ul
，将以上各个成分轻轻混合后，简单
离心，在37℃下孵育2h（延长孵育时间并不能增加标记的
RNA
的产量；按每1ug模板，可以产生10ug探针RNA）。
9、
向上述反应体系中，加入RNase-free的2ulDNaseⅠ，37℃
保温15min,以消除模板DNA。
10、向上述反应液中，加入
2ul0.2M的EDTA（pH8.0）以终止反
应，RNA转录子可以通过琼脂糖凝胶电泳EB染色来进行分析。
11、标记好的探针，不能用苯酚
氯仿进行抽提，这样会导致探针
分解。
标记好的探针可以在－15-－25℃，稳定保存至少一年；
要避免反复冻融标记好的探针，可以对其进行小管分装，方便
使用。
12、
需要的试剂：
RNADilutionBuffer:
DMPC
处理的RNase-free的双蒸水:
20×SSC:
formaldehyde=5：
3:
2（需要配置新鲜的）；
大飞传给我的：
4）反应结束后加入30μLRNasefree水和30μLLiCl，离心混匀，
-20℃1hr
5）14000rpm，4℃离心5min，加入1mL70%乙醇；
6）14000rpm，4℃离心15min，尽量弃上清；
7）室温晾置5-6min：
8）加入30μLDEPCH20，RNAsein1，μL-80℃保存。
12、吸取少量标记好的探针，进行琼脂糖凝胶电泳，
以检测其质量。
好的探针应该会出现一个或两个分离的条带，而不是拖尾，如是拖尾意味着探针有所降解了。
探针标记：
1、用地高辛标记的UTP在体外进行转录（载体pPST18），
以获得正义和反义RNA探针，将其溶入无RNase的去
离子水中。
探针转录体系如下：
整体原位杂交步骤：
胚胎的准备、固定与保存
1、收集西伯利亚鲟的一定数量未受精卵和受精后各个发育
时期的胚胎，用蛋白酶（浓度：
）或手动医用镊子以去除其
卵壳。
2、将未受精卵和各期胚胎加入10倍体积的4%多聚甲醛中，
4℃过夜。
3、在PBS缓冲液中漂洗胚胎若干次，然后分别依次以不同
比例（25%:
75%、50%：
50%、75%：
25%）的甲醇∕PBST，对胚
胎进行梯度脱水，每次5min;再用100%甲醇洗一次，时间为
5min，最后转至100%甲醇中，-20℃保存备用。
整体原位杂交步骤：
原位杂交第一天：
1、胚胎的复水
在室温下进行以下实验操作，分别依次以75%MeOH/25%
PBST、50%MeOH/50%PBST、25%MeOH/75%PBST洗胚胎，以上三
操作每次清洗时间为5min；最后用100%PBST漂洗4次，每次5min。
2、用蛋白酶K消化处理及再固定
室温下，以一定浓度（浓度:
10μg/ml）蛋白酶K（用PBST稀释），
处理各时期胚胎：
最佳处理时间需根据胚胎发育时期而定（也有言
24h以前的不用处理；而其他时期可以聊做参考其他鱼类的：
如周励
的鲫鱼小于5体节期可以不用处理、10体节期处理5min；24体节处
理10min；对于斑马鱼：
小于5体节期不用处理，10体节期处理1min、
24h处理5min、48h处理15min；）。
用PBST清洗胚胎5min，以洗去
蛋白酶K，最后再用PBST洗胚胎5min，以洗去残留的蛋白酶K。
然后在室温条件下，用4%多聚甲醛重新固定胚胎，时间为20min（？
对于鲟鱼是否也要适当的延长固定的时间）；再用1×PBST清洗胚胎
4（或者3或2次）次，每次5min，以除去残留的多聚甲醛，最后一
次清洗将胚胎转移至新的1.5ml的eppendorf管中。
（如果以斑马鱼的
胚胎大小为准，可以放置多达50颗胚胎。
）
注：
关于蛋白酶K的消化，时间太短会使探针不能进入，时间太长将
会改变胚胎的形态结构。
ProteinaseKPrepare10mg/ml
stocksolutioninPBTandstoreat-20℃in100ulaliquots.Final
concentrationforembryopermeabilizationis10ug/ml；斑马鱼的胚胎
各期消化时间可以参与在第七页[1]，
3、准备预杂交和杂交混合液
4、Hybridizationmix（HM）：
50%deionizedformamide，5×SSC，
0.1%Tween20，50ug/mlofheparin，500ug/mlofRNase-free
tRNAadjustedtopH6.0（6.3大飞）byaddingcitricacid（460ulof
1Mcitricacidsolutionfor50mlofHM）。
预杂交液HYB－：
50%甲酰胺、5xSSC（用20xSSC母液稀释）、
RNase-free水，0.1%吐温-20。
用柠檬酸（citricacid）调节pH至6.0。
5、
杂交液+：
HYB
甲酰胺（Formamide）50%；5xSSC；肝素（Heparin），50μg/ml；
吐温-20（Tween-20），0.1%；tRNA，500μg/ml；
用柠檬酸（citricacid）调节pH至6.0。
6、预杂交
除去PBST，每管取约5-10枚胚胎，向1.5ml的eppendorf管中加入700ul（适量体积）HYB－进行预杂交，在杂交炉中60-68℃保温5min；
然后，换用适量体积的HYB＋溶液，68℃预杂交4-6h（70℃，2-5h、
其他如roche采取55-65℃或）在70℃条件下，水浴2-5小时。
？
？
？
作用？
（注：
这些预杂交后的胚胎可以在HM中，-20℃条件下保存数
周）
7、杂交：
实验设计反义RNA、正义RNA、空白对照组。
用HYB＋溶液将地
高辛标记的探针稀释到1ng／ul,72℃加热变性5min，马上置于冰上
冷却，以消除探针的二级结构；弃去预杂交液HYB＋，加入新的700ul
（其他体积也可以）的HYB＋溶液和适量的探针，使探针的浓度为1ng
／ul，65-68-70℃孵育过夜（12-16h）。
（加入包含终浓度为0.5-1.0ng
∕μl（30-50ng这个是参考文献[1]）的地高辛标记的反义RNA探针的HM溶液
200μl，70℃条件下杂交（有的文献72或80℃加热5min变性，冰上冷却，以此消除探针的二级结构）（杂交炉中？
），过夜（也有65℃,5h；60℃杂交炉中，16h）。
注：
1
、不要使用过量的RNA探针，这会增加背景labeling；2、如此高的杂交温度和HM缓冲液中甲酰胺的比例，保证了探针杂交的严谨度（stringency）和减少了交叉杂交（cross-hybridization）的发生。
杂交温度不要超过72℃，否则探针被
破坏。
空白对照组不加入探针。
孵育时，加入的HYB＋应首先预热到70℃，
在之后再加入适量探针。
原位杂交第二天：
1、将含有探针的HYB＋溶液吸出，-20℃保存，并可多次重复使用
中，一般可使用十次左右，而能够重复使用的次数取决于探针
的质量，使用次数越多，得到的信号可能越弱；以下步骤在
65-68℃的杂交炉中进行，且注意溶液要预热。
洗去多余的探针：
依次用50%甲酰胺／2×SSCT，30min／次，2次；2×SSCT，15min
／次，1次；0.2×SSCT，30min／次，2次（其实可以如下增加
75%、25%）。
（或另一方法：
将胚胎的溶液介质环境由HM逐渐
过渡到2×SSC，以除去残留在介质中的探针：
由HM经过
75%HM、50%HM、25%HM、100%2×SSC，以上每一个步骤都
要在70℃水浴中进行并轻轻摇动，每次10min，而不同稀释度的HM用2×SSC稀释，且以上用来洗脱残留探针的HM不包含tRNA和肝素钠（heparin）。
；在70℃条件下，用0.2×SSC漂洗
胚胎两次，每次30min，如此高严谨性的漂洗以防止探针非特异性杂交；）
2、以下步骤在室温下进行，通过用一系列1×PBT稀释的0.2×SSC漂洗胚胎，逐渐用PBT取代0.2×SSC，方法如下：
在室温条件下，用一定体积？
的75%0.2×SSC、50%0.2×SSC、25%0.2
×SSC和1×PBT，逐次漂洗胚胎各1次，15min／次，并置于水平摇床上（horizontalshaker）以40r.p.m轻摇。
封闭：
1、做此步骤的前提是不用做前面杂交的步骤2，即是用马来
酸缓冲液MABT清洗胚胎3次，5min／次，
3、室温下，用适量封闭缓冲液（blockingbuffer：
10%羊血清、2%
阻断液，两者溶于MABT；三者MABT:
羊血清：
阻断剂=7:
1:
2；
也有用：
1×PBT，2%sheepserum（vol/vol），2mg／mlBSA）温
育（incubate）胚胎1-3h，并置于摇床上轻微摇晃，此步骤在于使抗体的非特异性结合位点饱和（saturates）。
4、（也即是：
更换新鲜的封闭缓冲液，加入比例1:
5000的抗地高辛荧光素标记的抗体，）将胚胎置于含1/10000（多数文献是1:
5000）抗地高辛荧光素标记的抗体的封闭缓冲液中，4℃过夜，且置于以40r.p.m.的水平摇床（振荡器？
）上（horizontalshaker）
轻轻摇晃。
原位杂交第三天：
1、弃去抗体溶液，并用PBT简要地（briefly）漂洗胚胎；然后室温下，再用PBT漂洗胚胎6次，每次15min，每次漂洗的同时将其置于horizontalorbitalshaker以40r.p.m.轻轻摇晃。
（其他
漂洗方法：
？
），干燥？
（其他漂洗方法重点参考：
室温下洗去
多余的抗体：
hybridizationsolutioncontains50%formamide
（UltraPurefromUSB,USA）in2×SSC，罗氏202页资料：
分别用不同混合比例的杂交缓冲液（hybridizationsolution）／1×PBS（3:
1、1:
1、1:
3）清洗胚胎，每次20min，各1次，最后用1
×PBS清洗胚胎4次，15min／次）
2、室温下，用alkalineTrisbuffer（配方见文献1，这个对于AP及
其底物显色才合适）在horizontalorbitalshaker上以40r.p.m.轻轻摇晃，进行漂洗3次，每次5min。
3、这个步骤对于AP除去alkalineTrisbuffer，用新鲜配制的0.7ml染色液将其替代，并置于黑暗环境中（这个步骤是按照
AP-BCIP\NBT来进行的）。
检测观察拍照并记录：
1、是否还需要4%多聚甲醛固定？
，原位杂交胚胎经梯度甘油
／PBST透明后（30%甘油／PBST、50%甘油／PBST、70%甘油／
PBST、100%甘油／PBST），连同少量100%移到载玻片，观察拍照。
拍照后可移回4%PFA？
或甲醇中？
保存
杂交漂洗缓冲液HyB-:
甲酰胺（Formamide）50%；
5xSSC；
吐温-20（Tween-20），0.1%；
用柠檬酸（citricacid）调节pH至6.0。
1、可选择做法：
在加入胚胎之前，预热HyB–；
2、将包含RNA探针的HyB+吸出，保存于-20℃；在没有如何信号损失的情
况下，该探针可以重复多次使用。
3、100%HyB–，70℃短暂地漂洗；
4、75%HyB–∕25%2xSSCT，70℃，15min；
5、50%HyB–∕50%2xSSCT，70℃，15min；
6、25%HyB–∕75%2xSSCT，70℃，15min；
7、2xSSCT，70℃，15min；
8、0.2xSSCT，70℃,30min，漂洗2次（如果第一天杂交使用的是50%甲酰胺，
以下相同）；或0.05xSSCT，70℃,30min，漂洗2次（如果第一天杂交使用的
是65%甲酰胺）（注：
对于）
9、75%0.2（or0.05）xSSC/25%PBT
，室温，10min；
10
、50%0.2（or0.05）xSSC/50%PBT
，室温，
10min；
11
、25%0.2（or0.05）xSSC/75%PBT
，室温，
10min；
12
、PBT，室温，10min；
13
、加入杂交封闭液：
PBT/2%羊血清/2mg/mlBSA（有的文献周励加入roche
的阻断剂于MABT中，前面步骤也有此方面的操作，
待确定？
？
？
），室温下，
孵育若干小时（3小时）？
14
、换上新鲜的杂交封闭液，加入荧光素（fluorescein）标记的抗地高辛的抗体
反应液（1:
200），4℃摇洗过夜。
.
原位杂交第三天：
漂洗：
室温下，
升级会员 