分子实验报告Word文档格式.docx
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3.1真核生物基因组DNA的提取及含量纯度检测
仪器、材料与试剂:
仪器:
离心机、恒温水浴箱、紫外分光光度计;
石英比色皿、恒温培养箱、琼脂糖凝胶电泳系统、小型高速离心机、高压灭菌锅、微波炉、PCR仪,灭菌锅、双蒸水器、冰箱,电泳设备、紫外分析仪、移液器、枪头、一次性手套、0.2ml离心管及架、冰块。
材料:
BEL7402肝癌细胞、细胞基因组DNA.引物
试剂:
百泰克基因组DNA提取试剂盒、无菌水、50×
TAE(50倍体积的TAE贮存液)
凝胶加样缓冲液(6×
)、琼脂糖、溴化乙锭溶液(EB)0.5µ
g/mL、DNA分子量标准(DNAMarker)、10×
PCRBuffer;
20mMdNTPmix:
含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各20Mm;
Taq酶1U/μl;
灭菌双蒸水ddH2O;
琼脂糖。
3试剂:
MboI、10×
Buffer、ddH2O、琼脂糖、凝胶回收试剂盒、TAEBuffer、电泳上样缓冲液、EB、DNAMarker
实验方法
3.1.1真核生物基因组DNA的提取
1、加入缓冲液TB200μl重悬BEL7402冻存细胞沉淀,12,000rpm离心10秒,
2、将细胞重悬于200μl缓冲液TB中。
3、加入200μl裂解液CB,立刻缓慢颠倒充分混匀,再加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液,充分混匀,70℃水浴10分钟。
4、冷却至室温后加入100μl异丙醇,颠倒轻摇充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
但不可用手剧烈振荡,以免剪切DNA。
5、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)10,000rpm离心80秒,倒掉收集管中的废液。
6、加入500μl抑制物去除液IR,12,000rpm离心80秒,弃废液。
7、加入700μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!
),12,000rpm离心80秒,弃掉废液。
8、加入500μl漂洗液WB,12,000rpm离心80秒,弃掉废液。
9、将吸附柱AC放回空收集管中,12,000rpm离心3分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
10、取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热),室温放置3-5分钟,12,000rpm离心1分50秒。
将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rpm离心2分钟。
11、可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
3.1.2基因组DNA的鉴定-琼脂糖凝胶电泳法
1、实验用1%琼脂糖。
称取0.3g琼脂糖,放入锥形瓶中,加入30mL1×
TAE缓冲液,置微波炉加热至完全溶化,取出摇匀即可。
2、将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。
3、在冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液中加入EB(1.5ul/30ml),缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
4、待胶凝固后,小心地拔出梳子,然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。
注意:
DNA样品孔应朝向负电极一端。
5、加电泳缓冲液至电泳槽中,加液量要使液面没过胶面。
6、用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。
7、接通电泳槽与电泳仪的电源。
DNA的迁移速度与电场强度成正比,一般电场强度不要超过5V/cm。
8、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处,停止电泳。
3.1.3基因组DNA纯度的鉴定-紫外分光光度计法
1.UV-2000紫外分光光度计开机预热30min,用黑体调透光率为零(校准仪器)。
2.用重蒸水洗涤比色皿,吸水纸吸干,加入TE缓冲液后放入样品室,关上盖板。
3.用空白对照调透光率为100%。
4.将待测样品适当稀释(DNA10μl用洗脱缓冲液EB稀释至100μl)后记录编号和稀释度。
5.把装有待测样品的比色皿放进样品室架上,关闭盖板。
6.设定紫外光波长,分别测定260nm、280nm波长时的OD值。
7.计算待测样品的浓度与纯度。
3.1.4目标基因扩增
1.分组:
每个实验组做两个PCR反应,分别用Bel7402细胞基因组DNA和对照样品基因组DNA为模板,第一、二组做对照样品1,第三、四组做对照样品2,第五六组做对照样品3。
2.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.2ml离心管中,总体积50μl
共做两组,其中一组用无菌水来代替模版DNA。
PCR反应体系如下:
加ddH2O
34μl
10×
PCR缓冲液
5μl
dNTPmix(各2.5mM)
4μl
上游引物(10μM)
2μl
下游引物(10μM)
DNA模板(50ng/μl)
Taq酶(1U/μl)
1μl
3.调整好反应程序,将上述混合液稍加离心,立即置于PCR仪上,执行扩增。
PCR反应的程序:
(1)
94℃
3min
(2)
30sec
(3)
60℃
(4)
72℃
1min
(5)
(2)-(4)
34cycles
(6)
10min
4.PCR产物的电泳检测:
制备2%的琼脂糖凝胶对PCR产物(5ul)进行电泳检测,观察结果。
(步骤同“DNA分子量测定”,产物大小249bp)
1.酶切反应:
按下列组成配制酶切反应体系,并混匀:
Buffer
2μL
ddH2O
12μL
MboI(1U/ul)
1μL
PCR产物
5μL
37℃温浴3小时。
2.酶切反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测(实验步骤如前所述)。
第二部分基因组DNA纯度的鉴定-紫外分光光度计法
实验原理:
由于核酸中的碱基都具有共轭双键,所以具有紫外光吸收性质。
核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线,其吸收高峰在260nm处。
蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处,所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。
纯度鉴定时,需测定在260和280nm处的吸光度。
数据表明,纯净的核酸溶液A260/A280的吸光度比值大于或等于1.8。
A260/A280值过小,说明存在蛋白质等的污染。
含量测定时,对于纯净的DNA来说,在实际应用中可根据260nm处的消光值OD260值换算成含量,一般认为OD260值为1时,相当于50μg/ml。
实验步骤:
实验结果:
第三部分基因组DNA的鉴定-琼脂糖凝胶电泳法
实验原理:
以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳广泛用于核酸研究中,其操作简单、快速,是分离、鉴定、纯化DNA的标准方法。
DNA分子在高于其等电点的PH溶液带负电荷,在电场中向正极移动。
DNA分子在电场中通过凝胶介质而泳动,除电荷效应外,还有凝胶介质的分子筛效应,也就是说与分子大小构象有关。
实验表明DNA迁移率与分子量的对数成反比。
因此通过参比已知标准分子量的DNA迁移率,可测定样品DNA的分子量。
染料溴化乙锭(EB)使凝胶中DNA区带染色,在紫外光下可直接显示DNA在凝胶中的位置,灵敏度很高,可检出10ng或更少的DNA含量。
仪器、材料与试剂
1
实验步骤:
1、制备琼脂糖凝胶:
根据被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。
可参照下表:
琼脂糖凝胶浓度%
线性DNA的有效分离范围/kb
0.3
5—60
0.6
1—20
0.7
0.8—10
0.9
0.5—7
1.2
0.4—6
1.5
0.2—4
2.0
0.1—3
实验用1%琼脂糖。
2、胶板的制备:
(1)将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。
(3)在冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液中加入EB(1.5ul/30ml),缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
(4)待胶凝固后,小心地拔出梳子,然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。
(5)加电泳缓冲液至电泳槽中,加液量要使液面没过胶面。
3、加样:
用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。
4、电泳
(1)接通电泳槽与电泳仪的电源。
(2)当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处,停止电泳。
在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。
DNA存在处应显出桔红色荧光条带
实验一真核生物基因组DNA的提取及含量纯度检测
实验目的:
1、学习高等真核生物基因组DNA的快速提取方法。
2、了解基因组DNA的鉴定技术。
第一部分真核生物基因组DNA的提取
真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内,因此,制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整。
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
SDS可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离。
蛋白酶K可将蛋白质降解,灭活细胞内核酸酶。
本次试验采用基因组DNA提取试剂盒。
独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
1仪器:
离心机、恒温水浴箱
2材料:
BEL7402肝癌细胞
3试剂:
百泰克基因组DNA提取试剂盒
1、加入缓冲液TB200μl重悬BEL7402冻存细胞沉淀,13,000rpm离心10秒,使细胞沉淀下来。
弃上清,留下细胞团和大约10-20μl残留的液体。
2、将细胞重悬于200μl缓冲液TB中。
9、将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分50秒,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分50秒。
注意事项:
1、第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
2、结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
3、为避免降低活性,方便运输,提供蛋白酶K为冻干粉状,收到后,可短暂离心后,加入1毫升灭菌水溶解。
因为反复冻融可能会降低酶活性,因此溶解后立即按照每次使用量(20微升)分装冻存,-20℃保存。
4、避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
5、所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。
6、开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。
7、结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,
眼睛和衣服。
若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
1.仪器:
紫外分光光度计;
石英比色皿
2.材料:
前述制备的细胞基因组DNA
3.试剂:
无菌水
1.DNA样品的浓度:
每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。
双链DNA浓度(μg/μl)=OD260×
样品稀释倍数×
50/1000。
2.DNA样品的纯度:
OD260/280比值应大于1.8,如果低于1.8,表示存在蛋白质等的污染。
注意事项:
1.测定前应通电30min使预热。
2.校正调零:
要固定参比杯和样品杯。
在260nm和280nm处需校正零点。
3.比色杯使用:
①每次检测前后必需用蒸馏水将比色杯清洗干净。
②严禁用手指触摸透光面,因指纹不易洗净。
严禁用硬纸和布擦拭透光面,只能使用镜头纸和绸布。
③严禁加热烘烤。
1仪器:
恒温培养箱、琼脂糖凝胶电泳系统、小型高速离心机、高压灭菌锅、微波炉。
2材料:
细胞基因组DNA.
1.50×
配1000mL50×
TAE:
Tris
242g
冰醋酸
57mL
EDTA(0.5mol/L)
200mL
调节pH8.0
2.凝胶加样缓冲液(6×
)
溴酚蓝
0.25%
蔗糖
40%
3.琼脂糖
4.溴化乙锭溶液(EB)0.5µ
g/mL
5.DNA分子量标准(DNAMarker)
EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌
面或地面上。
凡是玷污了EB的容器和物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。
实验二:
目标基因扩增
1、掌握PCR基因扩增的方法;
2、了解PCR原理及应用。
PCR技术又称聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction)技术,是一种在体外(试管、切片…)扩增核酸的技术。
该技术模拟体内天然DNA的复制过程。
其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下,特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:
①模板DNA的变性:
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②模板DNA与引物的退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍(Plateau)。
到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
PCR引物设计:
1、PCR引物设计的原则:
PCR反应的特异性及成功与否将与引物设计的好坏直接相关,PCR引物的设计又是立足于模板序列,而模板序列必须是已知的。
PCR作为一个体外酶促反应,其效率和特异性取决于两个方面,一是引物与模板的特异结合,二是聚合酶对引物的有效延伸。
引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。
2、引物设计的方法。
(1)手工设计:
以基因或cDNA的5’→3’方向的单链为标准,确定待扩增片段两侧的引物序列。
按5’→3’方向,照抄模板的序列,先写下5’端引物的序列;
然后根据模板3’的序列,写下由5’→3’方向的互补链的碱基序列,即为3’引物的序列。
(2)计算机软件设计引物:
目前在Internet网上提供很多免费在线引物设计程序,根据PCR引物设计的基本原则,输入诸如模板序列﹑扩增区域﹑扩增子长度﹑引物长度等限定参数时,便可得到有关引物最佳序列﹑引物起始碱基位置﹑引物的Tm值﹑引物GC%﹑引物的二级结构(如自身二聚体形成的发夹结构﹑引物间二聚体)﹑模板和引物结合的热力学参数。
不同的程序都有自己的特色,但都能满足设计引物的基本需要。
仪器、材料与主要试剂:
PCR仪,灭菌锅,双蒸水器,离心机,冰箱,电泳设备,紫外分析仪,移液器,枪头,一次性手套,0.2ml离心管及架,冰块。
(1)模板:
Bel7402细胞基因组DNA(前面实验已制备),3份对照样品基因组DNA(编号1,2,3,由实验中心提供)。
(2)引物:
本实验用PCR技术扩增MDR1基因上249bp片段。
引物序列为
MDR1E26F:
5’-TGTTTTCAGCTGCTTG