分子实验报告Word文档格式.docx

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3.1真核生物基因组DNA的提取及含量纯度检测

仪器、材料与试剂:

仪器：

离心机、恒温水浴箱、紫外分光光度计；

石英比色皿、恒温培养箱、琼脂糖凝胶电泳系统、小型高速离心机、高压灭菌锅、微波炉、PCR仪，灭菌锅、双蒸水器、冰箱，电泳设备、紫外分析仪、移液器、枪头、一次性手套、0.2ml离心管及架、冰块。

材料：

BEL7402肝癌细胞、细胞基因组DNA.引物

试剂：

百泰克基因组DNA提取试剂盒、无菌水、50×

TAE（50倍体积的TAE贮存液）

凝胶加样缓冲液（6×

）、琼脂糖、溴化乙锭溶液（EB）0.5µ

g／mL、DNA分子量标准（DNAMarker）、10×

PCRBuffer；

20mMdNTPmix:

含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各20Mm；

Taq酶1U/μl；

灭菌双蒸水ddH2O；

琼脂糖。

3试剂：

MboI、10×

Buffer、ddH2O、琼脂糖、凝胶回收试剂盒、TAEBuffer、电泳上样缓冲液、EB、DNAMarker

实验方法

3.1.1真核生物基因组DNA的提取

1、加入缓冲液TB200μl重悬BEL7402冻存细胞沉淀，12，000rpm离心10秒，

2、将细胞重悬于200μl缓冲液TB中。

3、加入200μl裂解液CB，立刻缓慢颠倒充分混匀，再加入20μl蛋白酶K（20mg/ml）溶液，充分混匀，70℃水浴10分钟。

4、冷却至室温后加入100μl异丙醇，颠倒轻摇充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

但不可用手剧烈振荡，以免剪切DNA。

5、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）10,000rpm离心80秒，倒掉收集管中的废液。

6、加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm离心80秒，弃废液。

7、加入700μl漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!

），12,000rpm离心80秒，弃掉废液。

8、加入500μl漂洗液WB，12,000rpm离心80秒，弃掉废液。

9、将吸附柱AC放回空收集管中，12,000rpm离心3分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10、取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热），室温放置3-5分钟，12,000rpm离心1分50秒。

将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟。

11、可以存放在2-8℃,如果要长时间存放，可以放置在-20℃。

3.1.2基因组DNA的鉴定-琼脂糖凝胶电泳法

1、实验用1％琼脂糖。

称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30mL1×

TAE缓冲液，置微波炉加热至完全溶化，取出摇匀即可。

2、将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。

3、在冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液中加入EB（1.5ul/30ml），缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

4、待胶凝固后，小心地拔出梳子，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。

注意：

DNA样品孔应朝向负电极一端。

5、加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面。

6、用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录点样顺序及点样量）。

7、接通电泳槽与电泳仪的电源。

DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V／cm。

8、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处，停止电泳。

3.1.3基因组DNA纯度的鉴定-紫外分光光度计法

1．UV-2000紫外分光光度计开机预热30min,用黑体调透光率为零（校准仪器）。

2．用重蒸水洗涤比色皿，吸水纸吸干，加入TE缓冲液后放入样品室，关上盖板。

3．用空白对照调透光率为100%。

4．将待测样品适当稀释（DNA10μl用洗脱缓冲液EB稀释至100μl）后记录编号和稀释度。

5．把装有待测样品的比色皿放进样品室架上，关闭盖板。

6．设定紫外光波长，分别测定260nm、280nm波长时的OD值。

7．计算待测样品的浓度与纯度。

3.1.4目标基因扩增

1.分组：

每个实验组做两个PCR反应，分别用Bel7402细胞基因组DNA和对照样品基因组DNA为模板，第一、二组做对照样品1，第三、四组做对照样品2，第五六组做对照样品3。

2.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.2ml离心管中，总体积50μl

共做两组，其中一组用无菌水来代替模版DNA。

PCR反应体系如下：

加ddH2O

34μl

10×

PCR缓冲液

5μl

dNTPmix（各2.5mM）

4μl

上游引物（10μM）

2μl

下游引物（10μM）

DNA模板（50ng/μl）

Taq酶（1U/μl）

1μl

3.调整好反应程序，将上述混合液稍加离心，立即置于PCR仪上，执行扩增。

PCR反应的程序：

（1）

94℃

3min

（2）

30sec

（3）

60℃

（4）

72℃

1min

（5）

（2）-（4）

34cycles

（6）

10min

4.PCR产物的电泳检测：

制备2%的琼脂糖凝胶对PCR产物（5ul）进行电泳检测，观察结果。

（步骤同“DNA分子量测定”，产物大小249bp）

1.酶切反应:

按下列组成配制酶切反应体系，并混匀:

Buffer

2μL

ddH2O

12μL

MboI（1U/ul）

1μL

PCR产物

5μL

37℃温浴3小时。

2.酶切反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测（实验步骤如前所述）。

第二部分基因组DNA纯度的鉴定-紫外分光光度计法

实验原理:

由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。

核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nm处。

蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。

纯度鉴定时，需测定在260和280nm处的吸光度。

数据表明，纯净的核酸溶液A260/A280的吸光度比值大于或等于1.8。

A260/A280值过小，说明存在蛋白质等的污染。

含量测定时，对于纯净的DNA来说，在实际应用中可根据260nm处的消光值OD260值换算成含量，一般认为OD260值为1时，相当于50μg/ml。

实验步骤：

实验结果：

第三部分基因组DNA的鉴定-琼脂糖凝胶电泳法

实验原理：

以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳广泛用于核酸研究中，其操作简单、快速，是分离、鉴定、纯化DNA的标准方法。

DNA分子在高于其等电点的PH溶液带负电荷，在电场中向正极移动。

DNA分子在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷效应外，还有凝胶介质的分子筛效应，也就是说与分子大小构象有关。

实验表明DNA迁移率与分子量的对数成反比。

因此通过参比已知标准分子量的DNA迁移率，可测定样品DNA的分子量。

染料溴化乙锭（EB）使凝胶中DNA区带染色，在紫外光下可直接显示DNA在凝胶中的位置，灵敏度很高，可检出10ng或更少的DNA含量。

仪器、材料与试剂

1

实验步骤:

1、制备琼脂糖凝胶：

根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。

可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度％

线性DNA的有效分离范围／kb

0.3

5—60

0.6

1—20

0.7

0.8—10

0.9

0.5—7

1.2

0.4—6

1.5

0.2—4

2.0

0.1—3

实验用1％琼脂糖。

2、胶板的制备：

（1）将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。

（3）在冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液中加入EB（1.5ul/30ml），缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

（4）待胶凝固后，小心地拔出梳子，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。

（5）加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面。

3、加样：

用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录点样顺序及点样量）。

4、电泳

（1）接通电泳槽与电泳仪的电源。

（2）当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处，停止电泳。

在紫外灯（360nm或254nm）下观察染色后的电泳凝胶。

DNA存在处应显出桔红色荧光条带

实验一真核生物基因组DNA的提取及含量纯度检测

实验目的：

1、学习高等真核生物基因组DNA的快速提取方法。

2、了解基因组DNA的鉴定技术。

第一部分真核生物基因组DNA的提取

真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。

提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离。

蛋白酶K可将蛋白质降解，灭活细胞内核酸酶。

本次试验采用基因组DNA提取试剂盒。

独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

1仪器：

离心机、恒温水浴箱

2材料：

BEL7402肝癌细胞

3试剂：

百泰克基因组DNA提取试剂盒

1、加入缓冲液TB200μl重悬BEL7402冻存细胞沉淀，13，000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。

弃上清，留下细胞团和大约10-20μl残留的液体。

2、将细胞重悬于200μl缓冲液TB中。

9、将吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm离心2分50秒，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分50秒。

注意事项:

1、第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

2、结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

3、为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解。

因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量（20微升）分装冻存，-20℃保存。

4、避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

5、所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000rpm的传统台式离心机。

6、开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。

7、结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，

眼睛和衣服。

若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

1.仪器：

紫外分光光度计；

石英比色皿

2.材料:

前述制备的细胞基因组DNA

3.试剂：

无菌水

1.DNA样品的浓度：

每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。

双链DNA浓度（μg/μl）=OD260×

样品稀释倍数×

50/1000。

2.DNA样品的纯度：

OD260/280比值应大于1.8，如果低于1.8，表示存在蛋白质等的污染。

注意事项：

1.测定前应通电30min使预热。

2.校正调零：

要固定参比杯和样品杯。

在260nm和280nm处需校正零点。

3.比色杯使用：

①每次检测前后必需用蒸馏水将比色杯清洗干净。

②严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。

严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。

③严禁加热烘烤。

1仪器：

恒温培养箱、琼脂糖凝胶电泳系统、小型高速离心机、高压灭菌锅、微波炉。

2材料：

细胞基因组DNA.

1．50×

配1000mL50×

TAE：

Tris

242g

冰醋酸

57mL

EDTA（0.5mol/L）

200mL

调节pH8.0

2．凝胶加样缓冲液（6×

）

溴酚蓝

0.25％

蔗糖

40％

3．琼脂糖

4．溴化乙锭溶液（EB）0.5µ

g／mL

5．DNA分子量标准（DNAMarker）

EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌

面或地面上。

凡是玷污了EB的容器和物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

实验二：

目标基因扩增

1、掌握PCR基因扩增的方法；

2、了解PCR原理及应用。

PCR技术又称聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction）技术，是一种在体外（试管、切片…）扩增核酸的技术。

该技术模拟体内天然DNA的复制过程。

其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍（Plateau）。

到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

PCR引物设计：

1、PCR引物设计的原则：

PCR反应的特异性及成功与否将与引物设计的好坏直接相关，PCR引物的设计又是立足于模板序列，而模板序列必须是已知的。

PCR作为一个体外酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。

引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。

2、引物设计的方法。

（1）手工设计：

以基因或cDNA的5’→3’方向的单链为标准，确定待扩增片段两侧的引物序列。

按5’→3’方向，照抄模板的序列，先写下5’端引物的序列；

然后根据模板3’的序列，写下由5’→3’方向的互补链的碱基序列，即为3’引物的序列。

（2）计算机软件设计引物：

目前在Internet网上提供很多免费在线引物设计程序，根据PCR引物设计的基本原则，输入诸如模板序列﹑扩增区域﹑扩增子长度﹑引物长度等限定参数时，便可得到有关引物最佳序列﹑引物起始碱基位置﹑引物的Tm值﹑引物GC%﹑引物的二级结构（如自身二聚体形成的发夹结构﹑引物间二聚体）﹑模板和引物结合的热力学参数。

不同的程序都有自己的特色，但都能满足设计引物的基本需要。

仪器、材料与主要试剂:

PCR仪，灭菌锅，双蒸水器，离心机，冰箱，电泳设备，紫外分析仪，移液器，枪头，一次性手套，0.2ml离心管及架，冰块。

（1）模板：

Bel7402细胞基因组DNA（前面实验已制备），3份对照样品基因组DNA（编号1,2,3，由实验中心提供）。

（2）引物：

本实验用PCR技术扩增MDR1基因上249bp片段。

引物序列为

MDR1E26F:

5’-TGTTTTCAGCTGCTTG