分子实验报告Word文档格式.docx

1、3.1真核生物基因组DNA的提取及含量纯度检测仪器、材料与试剂:仪器：离心机、恒温水浴箱、紫外分光光度计；石英比色皿、恒温培养箱、琼脂糖凝胶电泳系统、小型高速离心机、高压灭菌锅、微波炉、PCR仪，灭菌锅、双蒸水器、冰箱，电泳设备、紫外分析仪、移液器、枪头、一次性手套、0.2ml离心管及架、冰块。材料：BEL7402肝癌细胞、细胞基因组DNA.引物试剂：百泰克基因组DNA提取试剂盒、无菌水、50TAE（50倍体积的TAE贮存液）凝胶加样缓冲液（6）、琼脂糖、溴化乙锭溶液（EB） 0.5gmL、DNA 分子量标准（DNA Marker）、10PCR Buffer；20mM dNTPmix:含dAT

2、P、dCTP、dGTP、dTTP各20Mm；Taq酶 1U/l；灭菌双蒸水ddH2O；琼脂糖。3试剂：MboI、10Buffer、ddH2O、琼脂糖、凝胶回收试剂盒、TAE Buffer、电泳上样缓冲液、EB、DNA Marker实验方法3.1.1 真核生物基因组DNA的提取1、加入缓冲液TB 200l重悬BEL7402冻存细胞沉淀，12，000rpm离心10秒， 2、将细胞重悬于200l缓冲液TB中。3、加入200l 裂解液CB，立刻缓慢颠倒充分混匀，再加入20l蛋白酶K （20mg/ml）溶液，充分混匀，70水浴10分钟。4、冷却至室温后加入100l 异丙醇，颠倒轻摇充分混匀，此时可能会出

3、现絮状沉淀。但不可用手剧烈振荡，以免剪切DNA。5、将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）10,000 rpm离心80秒，倒掉收集管中的废液。6、加入500l抑制物去除液IR，12,000 rpm 离心80秒，弃废液。 7、加入700l漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心80秒，弃掉废液。8、加入500l漂洗液WB，12,000 rpm 离心80秒，弃掉废液。9、将吸附柱AC放回空收集管中，12,000 rpm离心3分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。10、取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜

4、的中间部位加100l洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在 65-70水浴中预热）， 室温放置3-5分钟，12,000 rpm 离心1分50秒。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000 rpm离心2分钟。11、可以存放在2-8,如果要长时间存放，可以放置在-20。3.1.2 基因组DNA的鉴定-琼脂糖凝胶电泳法1、实验用1琼脂糖。称取0.3g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30mL 1TAE缓冲液，置微波炉加热至完全溶化，取出摇匀即可。2、 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。3、 在冷到60左右的琼脂糖凝胶液中加入EB（1.5ul/30ml），缓缓倒入有机玻璃内槽，直至

5、有机玻璃板上形成一层均匀的胶面 （注意不要形成气泡）。4、 待胶凝固后，小心地拔出梳子，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。5、 加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面。 6、 用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录点样顺序及点样量）。7、接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5Vcm。8、当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。3.1.3 基因组DNA纯度的鉴定-紫外分光光度计法1UV-2000紫外分光光度计开机预热30min,用黑体调透光率为零（校准仪器）。2用重蒸水洗涤比色皿，吸水

6、纸吸干，加入TE缓冲液后放入样品室，关上盖板。3用空白对照调透光率为100%。4将待测样品适当稀释（DNA10l用洗脱缓冲液EB稀释至100l）后记录编号和稀释度。5把装有待测样品的比色皿放进样品室架上，关闭盖板。6设定紫外光波长，分别测定260nm、280nm波长时的OD值。7计算待测样品的浓度与纯度。3.1.4 目标基因扩增 1.分组：每个实验组做两个PCR反应，分别用Bel7402细胞基因组DNA和对照样品基因组DNA为模板，第一、二组做对照样品1，第三、四组做对照样品2，第五六组做对照样品3。2.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.2ml离心管中，总体积50l共做两组，其中一组用

7、无菌水来代替模版DNA。PCR反应体系如下：加ddH2O34l10PCR缓冲液5ldNTP mix（各2.5mM）4l上游引物（10M）2l下游引物（10M）DNA模板（50ng/l）Taq酶（1U/l）1l3.调整好反应程序，将上述混合液稍加离心，立即置于PCR仪上，执行扩增。PCR反应的程序：（1）943min（2）30sec（3）60（4）721 min（5）（2）-（4）34 cycles（6）10 min4.PCR产物的电泳检测： 制备2%的琼脂糖凝胶对PCR产物（5ul）进行电泳检测，观察结果。（步骤同“DNA分子量测定”，产物大小249bp）1.酶切反应:按下列组成配制酶切反应体

8、系，并混匀:Buffer2LddH2O 12LMboI（1U/ul） 1LPCR 产物5L37温浴3小时。2.酶切反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测（实验步骤如前所述）。第二部分 基因组DNA纯度的鉴定-紫外分光光度计法实验原理:由于核酸中的碱基都具有共轭双键，所以具有紫外光吸收性质。核酸在紫外光谱区有一条典型的吸收曲线，其吸收高峰在260nm处。蛋白质在紫外区的吸收高峰在280nm处，所以核酸的紫外吸收光谱数据是鉴定核酸的重要依据之一。纯度鉴定时，需测定在260和280nm处的吸光度。数据表明，纯净的核酸溶液A260/A280的吸光度比值大于或等于1.8。A260/A280值过小，说明存在蛋白

9、质等的污染。含量测定时，对于纯净的DNA来说，在实际应用中可根据260nm处的消光值OD260值换算成含量，一般认为OD260值为1时，相当于50g/ml。实验步骤：实验结果：第三部分 基因组DNA的鉴定-琼脂糖凝胶电泳法实验原理：以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳广泛用于核酸研究中，其操作简单、快速，是分离、鉴定、纯化DNA的标准方法。DNA分子在高于其等电点的PH溶液带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷效应外，还有凝胶介质的分子筛效应，也就是说与分子大小构象有关。实验表明DNA迁移率与分子量的对数成反比。因此通过参比已知标准分子量的DNA迁移率，可测定样品D

10、NA的分子量。染料溴化乙锭（EB）使凝胶中DNA区带染色，在紫外光下可直接显示DNA在凝胶中的位置，灵敏度很高，可检出10ng或更少的DNA含量。仪器、材料与试剂1实验步骤:1、制备琼脂糖凝胶：根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度线性DNA的有效分离范围kb0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13 实验用1琼脂糖。2、胶板的制备：（1） 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。（3） 在冷到60左右的琼脂糖凝胶液中加入EB（1.5ul/30ml），缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成

11、一层均匀的胶面 （注意不要形成气泡）。（4） 待胶凝固后，小心地拔出梳子，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。（5） 加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面。3、加样： 用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录点样顺序及点样量）。4、电泳（1）接通电泳槽与电泳仪的电源。（2）当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿12cm处，停止电泳。在紫外灯（360nm或254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带实验一 真核生物基因组DNA的提取及含量纯度检测实验目的：1、学习高等真核生物基因组DNA的快速提取方法。2、了解基因组DNA的鉴定技术。第一部分 真核生物基因组DN

12、A的提取真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离。蛋白酶K可将蛋白质降解，灭活细胞内核酸酶。本次试验采用基因组DNA提取试剂盒。独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗离

13、心的步骤, 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除， 最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。1 仪器：离心机、恒温水浴箱2 材料：BEL7402肝癌细胞3 试剂：百泰克基因组DNA提取试剂盒1、加入缓冲液TB 200l重悬BEL7402冻存细胞沉淀，13，000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来。弃上清，留下细胞团和大约10-20l残留的液体。2、将细胞重悬于200l缓冲液TB中。9、将吸附柱AC放回空收集管中，13,000 rpm离心2分50秒，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000 rpm

14、离心1分50秒。注意事项:1、第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!2、结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。3、为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状，收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解。因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量（20微升）分装冻存，-20保存。4、避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。5、所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以

15、达到13，000 rpm的传统台式离心机。6、开始实验前将需要的水浴先预热到70备用。7、结合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。1.仪器：紫外分光光度计；石英比色皿2.材料: 前述制备的细胞基因组DNA3.试剂：无菌水1. DNA 样品的浓度：每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。双链DNA浓度（g / l）= OD260样品稀释倍数50/1000。2. DNA样品的纯度：OD260/280 比值应大于1.8，如果低于1.8，表示存在蛋白质等的污染。注意事项：1. 测定前应通电30

16、min 使预热。2. 校正调零：要固定参比杯和样品杯。在260nm 和280nm 处需校正零点。3. 比色杯使用：每次检测前后必需用蒸馏水将比色杯清洗干净。 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。 严禁加热烘烤。1仪器：恒温培养箱、琼脂糖凝胶电泳系统、小型高速离心机、高压灭菌锅、微波炉。2材料：细胞基因组DNA. 150配1000mL 50TAE：Tris242 g冰醋酸57 mLEDTA（0.5mol/L）200 mL 调节pH 8.02凝胶加样缓冲液（6）溴酚蓝0.25蔗糖403琼脂糖4溴化乙锭溶液（EB） 0.5gmL5DNA 分子量标准（

17、DNA Marker）EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是玷污了EB的容器和物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。实验二：目标基因扩增1、掌握PCR基因扩增的方法；2、了解PCR原理及应用。PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管、切片）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板

18、DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍（

19、Plateau）。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR 引物设计：1、PCR引物设计的原则：PCR反应的特异性及成功与否将与引物设计的好坏直接相关，PCR引物的设计又是立足于模板序列，而模板序列必须是已知的。PCR作为一个体外酶促反应，其效率和特异性取决于两个方面，一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。引物设计的总原则就是提高扩增的效率和特异性。2、引物设计的方法。（1）手工设计：以基因或cDNA的53方向的单链为标准，确定待扩增片段两侧的引物序列。按53方向，照抄模板的序列，先写下5端引物的序列；然后根据模板3的序列，写下由53方向的互补链的碱基序列，即为3

20、引物的序列。（2）计算机软件设计引物：目前在Internet网上提供很多免费在线引物设计程序，根据PCR引物设计的基本原则，输入诸如模板序列扩增区域扩增子长度引物长度等限定参数时，便可得到有关引物最佳序列引物起始碱基位置引物的Tm值引物GC%引物的二级结构（如自身二聚体形成的发夹结构引物间二聚体）模板和引物结合的热力学参数。不同的程序都有自己的特色，但都能满足设计引物的基本需要。仪器、材料与主要试剂:PCR仪，灭菌锅，双蒸水器，离心机，冰箱，电泳设备，紫外分析仪，移液器，枪头，一次性手套，0.2ml离心管及架，冰块。（1）模板：Bel7402细胞基因组DNA（前面实验已制备），3份对照样品基因组DNA（编号1,2,3，由实验中心提供）。（2）引物：本实验用PCR技术扩增MDR1基因上249bp片段。引物序列为MDR1E26F: 5- TGTTTTCAGCTGCTTG