细胞生物学讲义Word格式文档下载.docx
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1.熟悉细胞的基本特征及类型。
2.熟悉细胞的大小、形态和数量与细胞功能间的关系。
二、目的和要求
1.掌握光镜下动、植物细胞的基本形态结构。
2.进一步掌握光学显微镜的使用方法。
3.初步掌握生物装片制作方法。
4.掌握生物绘图的基本方法。
三、材料和用品
1.光学显微镜，香柏油，擦镜纸。
2.兔小脑切片，蟾蜍皮切片，狗动脉切片，蟾蜍红细胞涂片，人精虫涂片，洋葱鳞茎表皮细胞装片，人口腔黏膜上皮细胞装片。
四、内容和方法
细胞（cell）是生命活动的基本结构和功能单位。
构成人体和其他高等动植物体的细胞种类繁多、形态各异。
细胞形态与其功能往往相适应，如具有收缩功能的肌细胞呈条形或长梭形；
运输O2和CO2的人成熟红细胞为双凹圆盘状；
具有感受刺激、传导冲动功能的神经细胞一般附有长短不一的树枝状突起；
精子细胞具有一根长长的鞭毛以帮助其游动等。
虽然细胞的形态、大小和功能各不相同，但在普通光学显微镜下，一般可见人体及动物细胞的基本结构可分为细胞膜（cellmembrane）、细胞质（cytoplasm）和细胞核（nucleus）三个部分。
但也有例外，如哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。
植物细胞的基本结构可分为细胞壁（cellwall）、细胞膜、细胞质和细胞核四个部分。
组织切片常用的染色方法为HE染色法，是用苏木精和伊红两种染料进行染色。
HE是苏木精（hematoxylin）和伊红（eosin）的首个字母缩写。
苏木精是碱性染料，使细胞核染色质和胞质内的核糖体呈紫蓝色；
伊红是酸性染料，使细胞质和细胞外基质中带较强碱基的蛋白质成分着红色。
观察及测量
（1）多角形细胞：
观察小白鼠肝细胞，细胞呈多角形，分界不太明显，以苏木精-伊红染色，细胞质染成红色，细胞核染成兰色，测量其细胞及细胞核的长短径。
（2）柱状细胞：
细胞是高柱状或低柱状，一苏木精-伊红染色，测量细胞及细胞核的长短径。
（3）梭形细胞：
河蚌外套膜表皮以内，为结缔组织，其中有横肌和纵肌切面，细胞呈梭形，染色方法同上。
（4）树枝状细胞：
观察兔脊髓运动神经元，分布在脊髓灰质中，细胞突起呈树枝状。
（5）卵园形细胞：
观察人血细胞涂片中的红细胞、白细胞。
5、细胞器的观察
⑴高尔基体
a，观察脊神经节细胞；
高尔基体银染成棕色，形状为网状或块状，分布在核周围的胞质中。
b，观察河蚌外套膜表皮细胞；
高尔基体染成棕色，呈网状，分布在柱状上皮的远心端（有极性分布）。
⑵线粒体
a，观察兔肝细胞：
线粒体呈兰色线、粒状，均匀地分布细胞质中。
b，观察兔小肠上皮细胞：
线粒体呈兰色线、粒状。
分布在柱状上皮细胞的细胞质中，分布呈两极状。
即主要分布在细胞的顶部和基部。
1.小脑神经细胞取兔小脑横切标本（硝酸银染色）置于显微镜下，低倍镜下观察可见有许多突起的小脑神经细胞；
油镜下可观察见胞体被染成黒褐色，形态多样（枣核形、三角形）、突起长短不一，有些细胞内可看到被染成棕黄色的、大而圆的细胞核。
2.上皮细胞取蟾蜍皮横切片（HE染色）置于显微镜下，低倍镜下观察可见蟾蜍上皮是由排列紧密的多边形扁平细胞和多边形柱状细胞组成；
油镜下观察可见颜色较浅的细胞外界，细胞核位于细胞的中央，呈圆形，被染成蓝紫色。
在上皮细胞下方可见被染成粉红色的结缔组织和肌细胞。
3.平滑肌细胞取狗动脉切片（HE染色）置于显微镜下，低倍镜下观察可以看到许多被染成粉色的平滑肌纤维，平滑肌纤维是梭形的细胞，平滑肌细胞彼此镶嵌排列，细胞界限不明显，被染成蓝紫色的椭圆形的细胞核位于细胞的中央。
4.人精子细胞涂片取人精子细胞涂片（铁苏木素染色）置于显微镜下，低倍镜下观察可见许多细小的被染成黑灰色的人成熟精子细胞；
高倍镜下观察可见精子细胞呈“蝌蚪形”，每个精子细胞都具有细长的尾丝。
5.蟾蜍红细胞取蟾蜍血细胞涂片（HE染色）置于显微镜下，低倍镜下观察可见蟾蜍红细胞为椭圆形，呈浅粉红色，细胞核位于中央，圆形或椭圆形，呈蓝紫色，高倍镜下观察隐约可见核仁。
6.洋葱鳞茎表皮细胞（自制临时标本）取洋葱肉质鳞茎一片，用镊子将其内表面的透明薄膜部分撕下，再用剪刀剪取3~4mm大小的一块，放在已加好一滴碘液的载玻片上，使其展平，然后盖上盖玻片，先用低倍镜观察，每个小格即是一个表皮细胞，其中有一个染色较深的细胞核。
转用高倍镜观察，可看到各个细胞都具有一层由纤维素组成的较厚的结构，此即细胞壁（它是植物细胞的重要特征之一）。
细胞膜紧贴在细胞壁之内，与细胞壁不易分开。
在细胞核内还可看到一个或多个的核仁，在核与细胞壁之间可以看到多少不等的颗粒存在，即原生质颗粒，有时可看到呈线条状分支的细丝，即原生质丝。
在原生质丝之间的空隙部分，为植物细胞特有的液泡，其中充满了细胞液。
在较老的细胞中，细胞核常被挤到膜的边缘部分，原生质也只有存在于边缘区域，在细胞中部则为大的液泡。
7.人口腔黏膜上皮细胞（自制临时标本）取一根牙签，用宽的一端在自己口腔中的面颊部轻轻刮取少许黏液，然后放在已加好一滴碘液的载玻片上，搅动涂匀，盖上盖片，在低倍镜下观察。
人的口腔上皮细胞为多角形细胞。
核被染成深黄色，镜下所见细胞成群或分散存在。
选择完整轮廓清楚的细胞。
转用高倍镜观察，可清楚地看到人口腔细胞外形扁平而不太规则，中央有一卵圆形的细胞核，细胞质均匀地分布于细胞核与细胞膜之间，其中具有颗粒。
五、实验报告
1.按生物绘图要求，绘制所看切片图。
2.按生物绘图要求，绘制蟾蜍红细胞图。
六、思考题
1举例说明细胞形态与功能的关系。
2动物细胞与植物细胞大小，结构的区别。
3计算并填表。
细胞的体积公式为：
椭球为：
V=4πab2（a为长半径，b为短半径）
球：
V=4/3πR3（R为半径）
2、根据观察与计算结果，填入下表：
细胞名称
形态特征
细胞体积
核体积
核质比例
实验二植物细胞骨架的显示及光镜观察
一、原理：
细胞内由微丝、微管、中间纤维等交织形成一个十分复杂的立体网络结构。
它们对于细胞形状的保持、细胞内物质运输、细胞运动、细胞内各结构相对位置的固定都有重要作用，故而称为细胞骨架。
细胞骨架在通常固定条件下不稳定，如低温、高压、酸处理等。
当采用适当的手段，如M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛在室温下固定能较好的保存细胞骨架的成分，另外，TritonX-100处理能抽取掉一部分杂蛋白，可使骨架成分显现的更加清晰。
微丝、微管、中间纤维等都是直径很小的结构。
最大的单根微管才25nm左右，只能在电镜下才能看见，目前研究细胞骨架的主要方法是应用高压电镜或免疫荧光显微技术，本实验用普通光镜观察到细胞骨架，是因为骨架纤维成束分布，结构经染色以后，有夸大作用。
由于细胞经TritonX-100提取剩下的主要成分是细胞骨架成分，使得显现等价清晰。
二、药品及器材：
材料：
洋葱鳞茎
器材：
显微镜、烧杯、吸管、镊子、载片、盖片
试剂：
M-缓冲液（配制方法如下）：
咪唑2.90g
KCl3.70gMgCl20.012g
EGTA0.38gEDTA0.042g
巯基乙醇0.086ml加水到1000ml6mM磷酸缓冲液
KH2PO40.74g
Na2HPO4·
12H2O2.4g
加水到1000ml
１％TritonX-100：
以M-缓冲液配制
３％戊二醛：
25％戊二醛12ml6nm磷酸缓冲液88ml染料：
考马斯亮蓝R-2500.2g冰醋酸7ml甲醇46.5ml蒸馏水46.5ml
三、实验操作：
1.撕取洋葱鳞茎内表皮表皮细胞（约1cm2）若干片置于盛有6mHpH6.8磷酸缓冲液中，使其下沉。
2.吸去磷酸缓冲液，加入１％TritonX-100处理２０－３０分钟。
3.吸去TritonX-100，用M-缓冲液洗三次，每次三分钟。
4.３％戊二醛固定３０－６０分钟。
5.pH6.8磷酸缓冲液洗三次，每次十分钟。
6.0.2%考马斯亮蓝R-250染色20-30分钟。
7.用蒸馏水洗1-2次，细胞置于载玻片上，加盖玻片，于普通光学显微镜下观察，就可以看到由微丝、微管组成的网络。
四、实验报告：
1.绘制洋葱细胞骨架的草图。
２.简述洋葱细胞骨架在细胞中的分布。
五、分析与讨论：
1、洋葱表皮细胞中，质膜下，核周，胞质中的细胞骨架的分布有无不同？
2、为什么试验中所看到的洋葱表皮细胞中细胞骨架有的成纤维状，有的成串球状？
实验三线粒体的提取与观察
线粒体（mitochondria）是真核细胞中产生能量的重要细胞器。
细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体时，可将组织匀浆液悬浮在悬浮介质中进行差速离心法进行分离。
在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），大小不一的颗粒沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在—定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2
的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
一、目的与要求
了解提取线粒体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般形态
二、基本原理
线粒体具有完整的结构，一定的大小和质量，低温条件下在等渗液中破碎细胞，差速离心后，获得线粒体。
经活性染料JanusgreenB染色，线粒体呈浅蓝色。
三、实验内容
1．线粒体的分离提取2.鼠肝的匀浆制备3.线粒体的活体染色
四、实验步骤
（一）动物组织线粒体的分离，提取与观察
1．鼠肝线粒体的分离
（1）徒手切一小薄片断头处死小鼠（饥饿24小时，尽量将血放肝，1/2000J.G.染色尽剖腹）
30分钟取肝（取0.5克肝剪成小块，用4℃
PH7.5，0.25mol/L的蔗糖溶
细胞匀浆液洗涤，去液后加5毫升蔗
糖液）
低速离心（4℃，3000转/分，10分）
2．涂片2张，结晶紫染色沉淀上清夜（线粒体，溶酶体，微粒体等）
（核，细胞等）
高速离心（4℃，11000转/分，15分）
3加入适量4℃的蔗糖溶液，
混匀，即为线粒体悬液沉淀上清夜（溶酶体，微粒体等）
（线粒体粗制品）
4.加入适量的蔗糖溶液，悬浮后高速离心
混匀，即为线粒体悬液
沉淀去上清液
（线粒体）
镜检
显微镜检查：
将1％JanusgreenB溶液按1:
1比例加入线粒体悬液中,在室温或水浴中染15~20分钟,用吸管吸取一滴线粒体悬液，滴于载玻片上，加盖玻片后，放显微镜下进行观察，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。
2．组织培养细胞的线粒体的提取与观察
洗涤细胞
先倒去细胞培养瓶中的细胞培养液，用移液管按5ml/瓶加入无钙镁盐（CMF）（PH7.0）。
消化细胞
倒掉瓶中的CMF液，用移液管按5ml/瓶加入预先配好的胰蛋白酶—EDTA消化液（配比1：
1，pH7.8）。
并在室温或37℃条件下消化，并不时观察。
分散细胞
肉眼观察单层细胞出现裂隙时，倒去消化液，加入Hank׳s液（5ml/瓶），然后用移液管吸进液体，并贴壁细胞面吹出Hank’s液至分散完全为止。
细胞匀浆
用滴管将细胞悬液转移到置于冰浴的匀浆器外套管中，并在冰浴条件下匀浆（一般要5—6次以上）。
离心去核
用滴管将匀浆后的悬液，转移到玻璃离心管中，平衡后在3000r/min条件下离心10分钟。
高速离心
用滴管吸取2/3上清液转移到冷冻高速离心机的离心管中，平衡后以10000r/min离心10～15分钟，倒去上清液，用滴管加入2～3mlHank’s液，悬浮平衡后再次离心15分钟。
悬浮收集
用滴管吸取少量Hank液，悬浮线粒体沉淀并转移到试管或离心管中，放于4℃冰箱或冰浴中保存。
染色，观察
用0.01JanusgreenB染液按基本等量的比例与线粒体悬液混合,在室温或冰浴中染色15~20分钟,用吸管吸取线粒体悬液,滴于载波片上,加盖玻片后,即可进行镜检,先在40倍镜下观察,然后换成油镜观察,线粒体为蓝绿色圆形颗粒.
（三）操作中应该注意的问题
1．整个操作过程为保证线粒体的完整，应尽量使操作时的环境如温度（0—4℃），pH（7.0左右）保持恒定，同时尽可能短操作时间。
2．组培细胞消化时要特别小心，防止损失或反复。
（损失指细胞脱落到消化液中）。
3．匀浆时，所用的介质一定是等渗缓冲液，常用的有0.25mol/L蔗糖溶液或生理盐水代替Hank’s液
4．匀浆次数依照匀浆器的松紧而定，次数过少，细胞破损不完全，就会影响线粒体产量。
5．所以取2/3上清夜用来制备线粒体是为防止细胞碎片过多影响观察。
6．整个分离过程，一般最好在30—60分钟内完成，不宜过长。
五、习题
1．叙述动物细胞线粒体的提取过程及其注意事项。
如何鉴定上述方法提取的最终产物是线粒体？
实验四石蜡切片的制作
一．实验目的：
通过对植物材料的固定、脱水透明、包埋、切片等实验操作，了解石蜡切片的基本过程，掌握石蜡切片的制作方法。
二．实验材料：
小鼠脏器
三．实验准备：
1．用具：
小标本缸，镊子，蜡杯，载玻片，毛笔，刀片，量筒，滴管，酒精灯，小木块，吸水纸，切片机，熔腊箱，展片台，真空泵，解剖针。
2．实验药品及配制：
试剂：
70%、85%、95%、100%的酒精,二甲苯,甘油蛋白,固定液,石蜡。
药品的配制：
卡氏固定液的配制：
冰醋酸∶乙醇=1∶3
甘油蛋白的配制：
取鸡蛋的蛋白加入等量的甘油搅拌混合，至均匀为止。
加入1%的麝香草酚，以防止微生物的侵入和腐败。
四．实验步骤：
1．取材固定：
用刀片切取实验材料，立即投入盛有卡氏固定液的小杯中。
固定液的用量约为材料的10-15倍，固定时间4-12小时。
2．洗涤：
倒出固定液，加入70%酒精，隔数小时后再换一次。
3．脱水与透明：
将材料从70%的酒精中取出，顺序放入85%乙醇（10分钟）→95%乙醇（10分钟）→100%乙醇（10分钟）→二甲苯1∶乙醇4（10分钟）→二甲苯2∶乙醇1（10分钟）→二甲苯4∶乙醇1（10分钟）→二甲苯→二甲苯（抽气3-5分钟）。
4．透蜡：
①．透蜡前，先作好准备工作，选取适当熔点的石蜡，融化，分装在
（1）号、
（2）号、（3）号三个蜡杯内，置入熔蜡箱，（55-60℃）。
另外，再准备一杯石蜡，供包埋用，也置于熔蜡箱内。
②．将以透明的材料从二甲苯中取出，防入蜡杯
（1）（30分钟）→蜡杯
（2）（30分钟）→蜡杯（3），半小时后即可包埋。
5．折纸盒。
6．包埋：
①．将热石蜡注入纸盒内，用镊子夹取组织块放入盒的中央位置。
②．将纸盒一半浸入冷水中，待表面石蜡凝成一层膜后，将纸盒迅速全部浸入冷水中，待石蜡全部凝结变硬即可取出。
7．修切蜡块：
把包埋好的蜡块用刀片修切成长方形。
8．固定蜡块：
取小木块，用蜡铲加上热石蜡，再融化蜡块底面，沾于小木块上，冷却后装在切片机上。
9．切片。
10．展片、贴片：
①．准备好展片台，使温度保持在比包埋石蜡的熔点底5-6℃。
②．取洁净的载玻片涂以甘油蛋白。
③．在涂有甘油蛋白的载玻片上滴二滴蒸馏水，用刀片将腊带切成适当长度的片段，以小镊子夹取腊带，使浮在玻片的水上。
再将玻片放在展片台上，腊带受热自动展开。
带完全展平后，用吸水纸吸去多余水分。
11番红固绿染色
五．作业
1．绘制出所观察到切片组织的解剖图。
2．简述石蜡切片的方法步骤。
实验五组织或细胞爬片HE染色方法
一、原理
苏木素（Hematoxylin）－伊红（Eosin）染色法，简称HE染色法。
HE染色法采用两种染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别于细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折光率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像。
该染色过程既有化学反应，又有物理作用参与。
从化学反应看，组织细胞内含有酸性物质和碱性物质，细胞的酸性物质与碱性染料的阳离子结合，而细胞核的碱性物质与酸性染料的阴离子结合，使其中酸性细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，而碱性的胞浆被酸性染料伊红染成红色。
其结果胞核呈蓝色，胞浆呈红色。
从物理现象看，主要有吸附、吸收之说。
HE染色提供良好的核浆对比染色，是细胞化学染色最常用的一种方法。
二、实验用品
1、固定液：
常用95％乙醇和冰丙酮
2、苏木精染液：
称取苏木精粉0.5g，铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中，然后取NaIO31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均匀，滤纸过滤，备用。
3、伊红染液：
称取0.5g水溶性伊红染液，溶于100ml蒸馏水中。
4、稀盐酸乙醇溶液：
用75%乙醇配制1％盐酸。
5、系列浓度的乙醇、二甲苯、中性树胶。
6、培养瓶、培养皿、眼科镊、盖玻片、载玻片、显微镜。
三、实验步骤
1、样品制备：
对于贴壁生长细胞，胰酶消化，调整细胞浓度约1×
105/ml，滴加于盖玻片上（置于6孔板中），培养相应时间后，取出细胞爬片，用PBS洗涤3次。
2、样品固定：
95％乙醇固定20min，PBS洗涤2次，每次1min。
3、染核：
苏木素染液染色2－3min，自来水洗涤。
4、分色：
镜下观察，若细胞核染色过深，用1％盐酸酒精溶液分色数秒，自来水洗涤。
5、染胞质：
浸入伊红染液染色1min，自来水洗涤。
6、吹干或自然晾干细胞爬片后，中性树胶封片。
注意事项：
1.若细胞用4％多聚甲醛固定，则染色时间相应延长，苏木素染色12-15min，伊红5min即可。
2.在整个染色过程中不让切片干涸：
切片完全干涸，会使组织收缩和出现裂痕即出现所谓“龟裂”现象。
也会使部分细胞核透明不良，看起来像黑色的细胞核，即形成“黑核”。
实验六
细胞器及内容物的观察
1线粒体的超活染色与观察
一、实验目的
1.
观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。
2.
学习一些细胞器的超活染色技术。
二、实验原理
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织某些结构能着色但又不影响细胞的生命活动和产生任何物理化学变化以致引起细胞的死亡的一种染色方法。
因此活染技术通常可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。
体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。
体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
詹纳斯绿B
是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；
而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。
三、实验用品
（一）材料
肝细胞、人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞
（二）器材
显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。
（三）试剂
1．Ringer
溶液
氯化钠
0.85g
氯化钾
0.25g
氯化钙
0.03g
蒸馏水
100ml
2.1%詹纳斯绿B
溶液（原液）
称取50mg
溶于5mlRinger，稍加微热（30～40℃），使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。
3.
溶液（应用液）
取1%原液1ml
加入49mlRinger
溶液,
混匀即可。
现用现配。
四、实验操作
人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察
（1）
取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴2
滴詹纳斯绿B
应用染液。
（2）
实验者用牙签宽头在自己口腔粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色10～15min（注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜
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