食物中化学物质基础毒性评价Word文件下载.docx
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以上4种参数是外源化学物急性毒性上限参数，以死亡为终点。
另外，还能够取得急性毒性下限参数，即：
⑤急性毒性LOAEL（观察到有害作用的最低剂量）；
⑥急性毒性NOAEL（未观察到有害作用的剂量）。
这两个参数则是以非致死性急性毒作用为终点。
因此，急性毒性实验能够分为两类。
一类是以死亡为终点，以检测受试物急性毒性上限指标为目的的实验，这种实验主如果求得受试物的LD50值。
另一类急性毒性实验检测非致死性指标。
二、经典急性致死性毒性实验
OECD（1987）关于经典急性毒性实验规定如下。
实验动物首选大鼠。
应设足够的剂量组，至少3组，组间有适当的剂量间距，产生一系列毒性和死亡率，以取得剂量-反映关系和求得LD50。
每组至少同性别5只动物，如用雌性动物，应未产和未孕。
限量实验剂量为2000mg/kg体重，用雌雄各5只动物进行实验。
观察期14天，临床观察天天至少一次，观察皮肤、被毛、眼睛和粘膜改变、呼吸、循环、自主和中枢神经系统、四肢活动和行为方式的转变，特别要注意有无震颤、惊厥、腹泻、嗜睡、昏迷等现象。
准确记录死亡时刻。
于染毒前、染毒后每周和死亡时测定体重。
所有的动物均应进行大体尸身解剖，并记录观察到的全数病变，存活24小时以上的动物必要时进行组织病理学检查。
可用任何一种公认的统计学方式计算LD50的值及95％的可信限范围，如B1iss法，Litchfield和Wilcoxon法，Finney法，Weil法，Thompson法，Miller和Tainter法等。
有关经典急性致死性毒性实验的要点如下：
1.实验动物选择和处置实验要求健康成年实验动物，一般是在小鼠、大鼠等动物中测半数致死量，并在狗中观察毒性反映。
一般啮齿类动物年龄与体重相关，故能够用体重表示动物年龄。
急性毒性实验一般用大鼠180～240g，小鼠18～25g，家兔2～2.5kg，豚鼠200～250g，狗10～15kg。
不同品系的同种动物年龄相同会出现体重不同，以小鼠为例，纯系小鼠如C57BL／6、BALB/C体重较小，而同年龄的昆明种小鼠则体重较大。
实验动物体重变异范围不该超过平均体重的20％。
所用实验动物应当是雌、雄各半，雌性实验动物要求是未经交配和受孕的。
若是发觉受试化学物急性毒性有性别不同时，应别离求出雌性与雄性动物的LD50值。
若是实验是为致畸实验作剂量预备，也可仅做雌性动物的LD50实验。
实验动物应进行检疫，检疫期一般为5～7天，剔除异样的动物。
检疫期与实验期间雌、雄动物必需分笼饲养。
实验动物按如实验设计的方式随机分组。
染毒途径应模拟人可能的接触途径。
经口灌胃染毒，要求实验前要对动物禁食。
大鼠应留宿禁食，小鼠应禁食4小时。
大动物则在每日上午喂食前给以受试化学物。
染毒后继续禁食2～4小时。
但在禁食时要保障饮水的供给。
2.实验设计在进行剂量设计之前，第一要了解受试外源化学物的结构式、分子量、常温常压下的状态（液态、固态或气态）、生产批号、纯度、杂质成份与含量、溶解度、挥发度、pH值（可测时）等等。
然后按照该受试物有关的测试规范要求，决定实验设计。
对于一个新的受试化学物，咱们能够先查阅文献找到与受试化学物的化学结构与理化性质相近的化学物毒性资料，取与本实验相同动物物种或品系，相同染毒途径的LD50值作为参考值，选择剂量系列。
例如，要测定氯乙酸的大鼠经口LD50，查文献可知乙醇大鼠经口LD50为10.8g／kg体重，乙酸为3.4g／kg体重，氯乙醇为71mg/kg体重。
故氯取代可增强毒性，推测氯乙酸的大鼠经口LD50应与氯乙醇相近，实测结果为78mg/kg体重。
剂量选择是不是适当是急性毒性实验可否成功的基础。
就啮齿类动物而言，总的原则是先用少量动物，以较大的剂量距离（一般是按几何级数）给药，找出10％～90％（或0％～100％）的致死剂量范围，然后在那个剂量范围内以适合的间距设几个剂量组。
在利用不同的方式计算化学物LD50时，实验设计中对剂量设计和动物数的要求不同。
急性致死性毒性实验能够不设阴性对照组。
3.观察染毒后一般要求观察14天。
观察实验动物的中毒症状，对于取得受试化学物的急性毒性特征十分重要，有助于了解该化学物的靶器官。
还应注意观察记录发生每种症状的时刻、症状表现程度、各症状进展的进程及死亡前特征和死亡时刻。
临床中毒反映和死亡时刻可提供中毒机制的线索。
如染毒后当即出现惊厥、共济失调和死亡可能是神经毒性。
经一段暗藏期后的迟发性死亡可能提示对肾或肝的作用。
腹泻和／或竖毛，可能为植物神经兴奋。
有些化学物（如有机磷类化合物）中毒症状进展迅速且专门快死亡。
而有些化学物的中毒症状进展缓慢，乃至出现症状减缓，尔后再发生严峻症状而死亡。
如碳基镍染毒初期先出现上呼吸道症状，当日即可减缓，2～3往后或更晚些才出现严峻的肺水肿，呼吸困难而死亡。
实验动物个体对受试化学物的反映性快慢也有不同，如过氧化二碳酸二环已酯给小鼠腹腔注射后，在同一剂量组中最先死亡的可在染毒后7小时，而最迟的可达染毒后150小时。
对于速杀性化学物也可仅按照24小时的死亡数计算LD50。
有些速杀性化学物（如久效磷），其24小时的LD50与14天的LD50没有不同。
若是报告24小时的LD50，则应在实验结果中加以说明。
在实际工作中，应该按照受试物的有关测试规程的要求来肯定观察期的长短。
固然，对于特殊的化学物不能完全固定观察期限。
化学物给实验动物染毒后，动物往往出现兴奋→抑制→死亡，或抑制→死亡的现象。
如以含有氰基的氰氢酸和丙烯腈对大鼠和小鼠染毒后，都专门快出现兴奋。
染毒丙烯腈的动物第一出现活动增加、骚动、窜跑、乃至跳跃，以后出现呼吸困难，耳与尾青紫色；
而氰氢酸呈一过性兴奋，呼吸加速、加深，以后呼吸困难，耳与尾则为桃红色。
可见同为氰化物，其中毒机制有所不同。
有的化学物给动物染毒后不久，动物先出现抑制现象，直至死亡。
例如N-苯甲酰基-N-（3，4-二氯苯基）-2-氨基-丙酸乙酪，给大鼠或小鼠灌胃致死剂量，动物专门快表现为闭目静卧、四肢无力、站立不稳、步态蹒跚、呼吸减慢，最后缺氧、口鼻青紫死亡。
有的化学物给予动物后，动物先出现刺激症状，如碳基镍吸入染毒在大、小鼠先出现前肢反复搔鼻等呼吸道刺激症状。
小鼠吸入染毒某些馏温段的冷油后，大汗淋漓，被毛全湿，表现为神经系统症状。
在观察期内还需多次测量动物体重，体重改变能够反映动物染毒后的整体转变。
实验动物染毒后的死亡时刻也应记录、分析，有时死亡时刻的分析能够提供一些重要信息。
例如久效磷小鼠经口与腹腔注射染毒，均呈现随染毒剂量增加，死亡时刻缩短。
以死亡时刻与染毒剂量作图，可呈直线负相关，提示实验动物致死是可能由于化学物原形所致。
而过氧化二磷酸二环己酯给大鼠腹腔注射后呈现明显的染毒剂量对数值与死亡时刻呈负相关关系，但给小鼠腹腔注射后，染毒剂量或染毒剂量对数与死亡时刻无明显相关。
这可能是与该化学物在大鼠和小鼠体内代谢不同有关。
急性毒性研究中，应注意观察非致死指标及其可复性，从而能够对化学物的急性毒性作全面的了解。
可复性毒效应是指随着化学物从体内消失而逐渐减小以至消失的毒效应。
毒作用的可复性与作用器官和系统、化学物本身的毒作用特点、化学物接触时刻、特按时刻内机体接触化学物的总量、动物的年龄及一般状况有关。
化学物引发机体激素失衡常常是一种可复性的反映，比如化学物对甲状腺的影响，若是没有超过致使甲状腺组织损伤的阈值，则常常是一种可复性的毒效应。
发生在组织再生能力迅速的器官（如肝）的损伤比发生在没有再生能力的组织（如神经）的损伤更可能是可复性的。
在动物研究中观察到的不可复性的毒效应，在外推到人时比可复性毒效应更为重要。
对中毒死亡的实验动物应及时解剖作大体尸检，观察各器官有无充血、出血、水肿或其他改变，必要时对肉眼观察有转变的脏器进行组织病理学检查。
实验结束时存活与对照组的动物也应作病理学检查。
死亡动物的大体尸检或组织病理学检查有时可取得有价值的资料。
4.LD50计算LD50是经统计学计算取得的毒性参数，并可报告其95％可信限。
LD50（LC50）值是一个统计量，较少受实验动物个体易感性不同的影响，较为准确，因此是最重要的急性毒性参数，也用来进行急性毒性分级。
对于非致死性指标的量化问题，能够利用ED50（medianeffectivedose）和相应的剂量-反映关系曲线来解决。
ED50是指一次给予实验动物某种化学物引发动物群体中50％的个体出现某种特殊效应的剂量，该指标也是通过统计学计算处置取得的。
图6-1急性毒性的剂量-反应曲线关系曲线模式图
由图6-1能够看到在以对数剂量为横轴，死亡率为纵轴的图中，随剂量增加，积累死亡率也增加，呈“S”形曲线；
若是以死亡频率为纵轴时，则不同剂量下死亡频率的散布呈正态散布，为典型的“钟罩”型；
而将积累死亡率转换为概率单位后作为纵轴时，则对数剂量与死亡率（概率单位）的图形则表现为直线。
因此咱们能够将剂量对数值与死亡率（概率单位）的关系，进行直线回归，用最小二乘法求出a、b值。
代入直线方程：
y＝a十bX。
式中，X为剂量对数值，y为死亡率的概率单位。
利用此式即可求得受试化学物的LD50及其95％可信区间。
对数剂量-反映曲线的斜率在进行危险性评价时比LD50的数值更重要。
Finney（1978）曾指出斜率是LD50标准差的倒数，反映了群体对此受试物反映的不同性。
平行的剂量-反映关系曲线可能提示这两种化学物的毒作用机制、动力学特征类似。
利用LD50来比较不同外源化学物急性毒性大小见图6-2。
化学物A、B、C的剂量反映关系曲线（已用剂量对数和死亡率（概率单位）转换成直线）的斜率相同，而LD50A＞B＞C，因此，急性毒性大小的顺序为C＞B＞A。
而化学物D的LD50与C相同。
但斜率比C大，可见在低于LD50的剂量时急性毒性C＞D，即在低于LD50的剂量时化学物C引发实验动物的死亡率高于化学物D。
图6-2四种不同外源化学物的LD50及剂量/反映（死亡）关系曲线
最小致死剂量（MLD）。
若是急性毒性实验取得较好的剂量-反映关系，则可直接计算LD0l（使一组实验动物1％死亡的剂量），并以LD0l作为MLD的估量值。
实际上，即便取得专门好的剂量-反映关系曲线，LD0l的可信限将是相当宽的，并包括了MNLD（最大非致死剂量）。
5.经典的急性致死性毒性实验的局限性对经典的急性毒性实验和LD50的意义，连年来一直有不同的意见：
①消耗的动物量大，按经典法的要求测LD50，一次实验需要60～100只动物。
②取得的信息有限，LD50的值又不能等同于急性毒性，死亡仅仅是评价急性毒性的许多观察终点之一。
化学物单次大剂量急性中毒，动物多死于中枢神经系统及心血管功能障碍，并非能专门好地显示出各自的毒作用特征，另外，由于死亡迅速，各类器质性转变尚未进展，不能显示出靶器官的病变。
③测得的LD50值实际上仅是近似值，1977年欧洲一路体组织了13个国家的100个实验室，统一主要的实验条件对5种化学物的LD50进行测定。
按照搜集到的80个实验室的结果分析，结果仍然存在相当大的不同，可达～倍（表6-1）。
④在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其他化验检查所提供的深切详细的毒性信息。
ICH（1991）规定在新药的报批材料中，没必要准确地测定LD50，只需了解其近似致死量和详细观察记录中毒表现即可。
为此，已进展了一些急性毒性实验的方式。
表6-l五种化合物的LD50值的实验室间变异
化合物范围（mg/kg）比值（最大值／最小值）
五氯酚74～620
水杨酸钠930～2328
苯胺479～1169
乙酰苯胺723～3060
氯化镉105～482
三、急性毒性分级
目前国际上对外源化学物急性毒性分级的标准不统一。
世界卫生组织的毒性分级标准可见表6-2。
欧洲一路体的急性口服毒性分级标准为：
高毒（VeryToxic，LD50＜25mg/kg）、有毒（Toxic，LD50为25～200mg/kg）、有害（Harmful：
LD50为200～2000mg/kg）、不分级（UncIassified，LD50＞2000mg/kg）等四个品级。
除参考国际上的几种分级标准外，我国于1978年提出了农药及工业毒物急性毒性分级标准及农药急性毒性分级暂行标准。
目前我国食物毒理则沿用了国际上六级标准，即极毒、剧毒、中等毒、低毒、实际无毒、无毒（表6-3）。
表6-2外源化学物急性毒性分级（WHO）
6只大鼠吸入4小时
毒性分级大鼠一次经口LD50死亡2～4只兔经皮LD50对人可能致死剂量
（mg/kg）的浓度（ppm）（mg/kg）g/kg（g/60kg）
剧毒＜1＜10＜5＜
高毒1～10～5～～3
中等毒50～100～44～～30
低毒500～1000～350～5～25
微毒50000～10000～2180～＞15＞1000
表6-3我国食物毒理急性毒性分级法[1994]
急性毒性分级大鼠经口LD50（mg/kg）大致相当于体重为70kg人的致死剂量
6级（极毒）＜1稍尝，＜7滴
5级（剧毒）1～507滴～1茶匙
4级（中等毒）51～5001茶匙～35克
3级（低毒）501～500035～350克
2级（实际无毒）5001～15000350～1050克
1级（无毒）＞15000＞1050克
四、急性毒性实验的其他方式
1.近似致死剂量的研究在肯定近似致死剂量的研究中，仅用6只动物，每只动物给以不同剂量的受试物，每一个剂量间距为倍。
这种实验设计能够取得近似最小致死剂量。
利用该方式测试了87种化学物，发觉83％的化学物近似致死剂量都位于用经典的急性毒性实验方案所取得的LD50的正、负30％范围之内。
另一种肯定近似致死剂量的方式是先选择一个剂量给予2只动物，24小时后，观察动物的情形，然后再按照动物反映肯定下一个给药剂量；
若是动物未死亡，以第一次给药剂量的倍剂量再次给予2只动物;
若是动物死亡，则以第一次给药剂量的2／3再次给予2只动物。
重复操作一直到肯定最大非致死剂量和最小致死剂量。
2.固定剂量法（fixeddoseProcedure）
固定剂量法是由英国毒理学会1984年提出，OECD于1992年正式采用。
这种方式与以往方式不同的是它不以动物死亡作为观察终点，那个方式能够利用预先选定的或固定的一系列剂量染毒，从而观察化学物的毒性反映来对化学物的毒性进行分类及分级。
实验选择的剂量范围是5、50和500mg/kg，而最高限量是2000mg/kg。
第一用50mg/kg的受试物给予10只实验动物（雌、雄各半）。
若是存活率低于100％，则再选择一组动物给予5mg/kg的受试物。
若是存活率仍低于100％，则将该受试物归于“高毒”类，反之归于“有毒”类。
若是给予50mg/kg受试物后存活率为100％，但有毒性表现，则不需进一步实验而将其归于“有害”类。
若是给予50mg/kg后存活率为100％，而且没有毒性表现，继续给另外一组动物500mg/kg的受试物，若是存活率仍为100％，而且没有毒性表现时，则给予2000mg/kg受试物进行观察，若是仍然100％存活，将受试物归于“无严峻急性中毒的危险性”类。
对于固定剂量法的结果评价可见表6-4。
OECD组织了对固定剂量法国际性的验证（VanDenHeuvell990），11个国家的33个实验室用固定剂量法和OECD（1981）规定的经典急性毒性实验法进行实验。
实验结果表明，①毒性分级：
比较了30个化合物的两种实验法所得结果，按照欧共体急性口服毒性的分级标准，516次固定剂量法实验中，有414次实验结果的毒性分级与LD50的分级相同，一致性为％。
②毒性反映：
从毒性反映的类别、出现和持续的时刻、消失的时刻等方面分析，两种实验方式未显出明显不同。
③实验所用动物数：
LD50经典急性毒性实验，平均每一个化合物用大鼠只，固定剂量法平均用大鼠只，明显比前者少。
表6-4单次口服固定剂量法实验结果的评价
剂量
（mg/kg）
试验结果
存活率〈100%100%存活，毒性表现明显100%存活，无明显中毒表现
高毒LD50≤25mg/kg有毒用50mg／kg试验
有毒或高毒有害用500mg/kg试验
用5mg/kg试验LD50200～2000mg/kg
有毒或有害LD50＞2000mg/kg用2000mg/kg试验
用50mg/kg试验
用500mg/kg试验该化学物无严重急性中毒的危险性
3.急性毒性分级法（acutetoxicclassmethod）
传统的急性毒性实验方式以死亡为终点，而固定剂量法以明显的毒性体征作终点。
OECD（1996）急性经口毒性分级法是分阶段实验法，每阶段3只动物，按照死亡动物数，平均经2～4阶段即可判定急性毒性。
所用动物少，仍可取得可同意的结论，此法基于生物统计学，并通过OECD组织的国际证明研究（Schlede等，1994）。
此法应用于啮齿类，首选大鼠，利用3个固定剂量25、200、2000mg/kg体重其中之一开始进行实验，按如实验结果：
①不需要进一步实验进行分级；
②下一阶段以相同剂量的另一种性别实验；
③下一阶段以较高或较低的剂量水平进行（从200mg/kg体重开始的程序见图6-3）。
于确认染毒动物存活后，进行下一个性别或下一个剂量的实验。
动物观察14天，染毒当天观察体征和死亡至少两次，以后每日观察一次。
染毒前和每周测体重，所有动物均进行大体解剖，必要时进行组织病理学检查。
图6-3急性毒性分级法:
以200mg/kg体重开始的实验方案
4.上、下移动法（up／downmethod）或阶梯法，该法可用于观察不同的终点，第二个动物同意化学物的剂量由第一只动物染毒后的反映决定，若是动物死亡，则下一个剂量降低；
若是动物存活则下一个剂量增高，可是实验需要选择一个比较适合的剂量范围，使得大部份的动物所同意的化学物剂量都会在真正的平均致死剂量左右。
若是剂量范围过大，则需要有更多的动物来进行观察。
对于该法进行改良以后，上、下移动法则只需要6～9只动物。
Lipnick等（1995）比较了上下法、固定剂量法和经典LD50法，按照EEC分级系统对化学品急性毒性分级，上下法和经典法一致性为23／25，上下法与固定剂量法一致性为16／20。
上下法需一个性别6～10只动物，少于另两种方式。
5.金字塔法（“pyramiding”study）
利用本设计观察动物急性毒性，动物用量最少。
典型的金字塔法研究在整个观察期内都给动物受试物，一般是隔天染毒，但剂量是逐渐增加的。
例如l、3、10、30、100、300、1000和3000mg/kg剂量系列或是10、20、40、80、160、320、640和1280mg/kg剂量系列。
给予动物的剂量一直按上述系列增加，直到一只动物或两只动物死亡，或达到剂量上限。
对于药物，非啮齿类动物一般很少超过1000mg/kg，啮齿类动物则很少超过3000mg/kg。
金字塔法常常利用于非啮齿类的动物的急性毒性研究。
实验组4只，对照组4只均雌雄各半，共8只狗。
实验组于实验第0、2、4、7、9天染毒，每次染毒后2～4h内进行临床体检，包括触诊，行为观察，脊髓反射检查、瞳孔光反射、呼吸率，心电图、直肠温度、临床实验室检查，于实验第10天处死实验组动物，并进行尸身解剖。
通过金字塔研究取得的资料能够取得三种结论：
①若是没有动物死亡，则最小致死剂量和LD50均大于极限剂量或实验所用最高剂量。
②若是所有动物死于同一剂量，则LD50和最小致死剂量在实验所用最后两个剂量之间。
③若是一只动物死于某一个剂量，而另一只死于高一个剂量，则最小致死剂量位于出现第一只动物死亡的剂量与前一个剂量之间，LD50则位于出现第一只动物死亡的剂量与所有动物死亡的剂量之间。
此法的缺点为：
①此法得不到死亡曲线，也无法计算LD50；
②本法无法肯定迟发的死亡，比如，第二次给药后动物出现死亡，则无法肯定是由于第一次给药引发的迟发死亡，仍是第二次给药引发的死亡；
③对于有些半衰期特别长的化学物，由于蓄积作用可能会致使取得的急性致死剂量偏低，而由于适应性的存在，可使取得的急性致死剂量偏高。
6.限量实验如受试物的毒性很低，可用限量实验。
一般啮齿类（大鼠或小鼠）20只，也有效10只，雌雄各半。
单次染毒剂量没必要超过5g／kg体重，也有以为剂量一般不超过2g／kg体重，对于食物毒理学实验限量可为15g／kg体重。
可能的结果为：
①若是实验动物无死亡，结论是最小致死剂量（MLD）大于该限量；
②若是死亡动物数低于50％，结论是LD50大于限量；
③若是死亡动物数高于50％，则应从头设计，进行常规的急性毒性实验。
按照二项散布，20只动物死亡5只，死亡百分率的95％可信区间为9％～49％。
因此，保守的观点以为若是死亡动物数为5只或5只以下，结论是LD50大于限量；
如死亡为6只或6只以上，即应从头设计实验。
用10只大鼠或小鼠进行实验，如无死亡或死亡动物数仅为1只，才能够为LD50大于限量。
7.急性系统毒性实验
此实验的设计是为了更全面地肯定药物的急性毒性。
共有3种，即最低急性毒性实验、完全急性毒性实验和补充的急性毒性实验。
在剂量设计上应注意，一般设3个剂量组和1个溶剂对照组。
最高剂量应有明显的毒性（包括死亡），但不需要使全数动物死亡。
若是受试物毒性很低可仅设1个限量组和1个对照
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