《基因工程》课程习题文档格式.docx
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C.
有些限制酶对同一DNA底物上不同酶切位点的切割速率会有差异。
D.
限制酶反应缓冲系统一般不用磷酸缓冲液，是由于磷酸根会抑制限制酶反应。
E.
BSA对许多限制酶的切割活性都有促进作用，所以酶切反应中常加入一定量的BSA。
8.II类限制酶反应中必须的阳离子是（C）
A.Na+B.Ca2+C.Mg2+D.Zn2+E.Mn2+
9.RFLP形成的原因是（A）
由于遗传变异造成同源染色体中碱基的随机变化。
B.
使用不同的限制性内切酶进行切割。
杂交时使用不同的探针。
D.
每种染色体存在两条。
E.
提取不同的染色体DNA酶切。
10.下列关于限制酶命名的表示方法，正确的是（E）
A.Sau.3AIB.B.amHIC.pstID.EcorIE.HindIII
11.需进行DNA部分酶切时，控制下列哪种条件最合适（D）
A.反应时间B.反应体积C.PHD.限制酶量E.反应温度
12.下列酶在反应中不需要ATP的是（D）
A.E
coKB.T4DNA连接酶C.BamHID.EcoBE.DNApolI
13.限制性内切酶可特异性识别（B）
A.双链DNA的特定碱基对B.双链DNA的特定碱基序列
C.单链RNA的特定碱基序列D.单链DNA的特定碱基序列E双链RNA的特定碱基对
14.下列与RFLP相关的一条是（D）
不同限制酶在单个染色体DNA上的限制性图谱。
两种物种个体间的限制性图谱。
同一个体等位基因的限制性图谱。
同一物种不同个体的限制性图谱。
非同源染色体用同种限制酶切形成的限制酶图谱。
15．限制酶的星号活性是指在非正常条件下，限制酶（A）
识别和切割序列发生变化。
切割活性大大提高。
C.
识别和切割序列与原来完全不同。
可以任意切割DNA。
只能部分切割DNA。
二、多选题
1.下列因素中影响限制酶切割的有（A,B,C,D,E）
A.EDTA浓度B.甘油浓度C.DNA纯度D.酶的自身活性E.盐浓度
2.限制酶反应中出现星活性的可能原因是（ABDE）
A．酶浓度太高B低盐C盐浓度过高D高PHE甘油浓度>
5%（V/V）
3．限制酶切割后的DNA电泳得到的电泳条带有些扩散，可能原因是（B，C，D，E）
A．酶失活B有蛋白质与DNA结合C酶切条件不合适D有外切核酸酶污染E星号活性
4．下列有关回文序列的描述正确的是（A，B，C）
A．是II类限制酶的识别序列B是某些蛋白的识别序列C是基因的旁侧序列D是高度重复序列E是卫星序列
5．下列有关回文序列的一般特征正确的是（B，C，D，E）
A．可增强基因表达B有对称轴C是自我互补的序列D．两条链从5‘-3‘方向的序列一致E是II类限制酶的识别序列
6．关于II类限制酶说法正确的是（B，D）
A．具内切核酸酶和甲基化酶活性B．仅有内切核酸酶活性C．只识别非甲基化的DNA序列
D．II类限制酶反应条件只需要Mg2+E．II类限制酶反应需要Mg2+,ATP
7．通过限制性片段分析，可对等位基因进行精确比较是因为（B，C）
A．限制酶只切割两个变异等位基因中的一个B．限制酶位点可作为遗传标记C．它不依赖变异的等位基因的产物的功能
D．不同组织等位基因的核苷酸序列存在差异E．同一组织等位基因核苷酸序列不会完全相同
8.下列关于II类限制酶的叙述正确的是（B，C，D，E）
A．它既有内切酶的活性，也有外切酶活性B．在特异位点对DNA进行切割
C．同一限制酶切割双链DNA时产生相同的末端序列D．有些限制酶切割双链DNA产生粘末端
E．有些限制酶切割双链DNA产生平末端
9．限制酶反应结果若显示没有切割，可能原因是（A，B，C，D，E）
A．限制酶无活性B存在抑制剂如SDS，EDTACDNA不纯D．缓冲液组成不合适EDNA甲基化
10．下列关于限制酶的叙述正确的是（B，C，D）
A．在限制与修饰系统中，修饰主要是甲基化作用，一旦位点被甲基化了，其他限制酶就不能切割了。
B．限制酶在DNA中的识别/切割位点的二、三级结构影响酶切效率。
C．如果限制酶的识别位点位于DNA分子末端，那么接近末端的程度也影响切割。
D．已知某限制酶在一环状DNA上有3个切点，因此该酶切割这一环状DNA，可得到3个片段。
E．能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中没有该酶识别的序列。
11．酶在储存过程中迅速失活，可能原因是（A，B，C，E）
A．储存温度不合适B稀释后储存C储存缓冲液不合适D．分装后储存E储存缓冲液中蛋白浓度低
12．限制酶切反应结果显示为部分切割，可能原因是（A，B，C，D，E）
A．限制酶失活B有抑制剂如SDS，EDTA等存在C反应条件不合适DDNA不纯EDNA结构（线形或超螺旋）的影响
13．如果用限制酶切割DNA后得到的片段比预期的多，可能原因是（B，C，E）
A．限制酶失活B限制酶的星号活性C有其他限制酶污染D有抑制剂存在E测试DNA中有其他DNA污染
14．限制酶切割后的产物连接反应效果差，可能原因是（A，B，C，E）
A．限制酶去除不完全B平端连接C核酸外切酶污染D．连接反应温度低于16℃
E．从限制酶消化中带来太高浓度的磷酸盐或其他盐类
15．下列限制酶属同裂酶的是（A，B，D，E）
A．BamHIG↓GATCCSau3AI↓GATC
CCTAG↑GCTAG↑
B．SalIG↓TCGACXhoIC↓TCGAG
CAGCT↓GGAGCT↓C
C．BamHIG↓GATCCEcoRIG↓AATTC
CCTAG↓GCTTAA↓G
D.HpaIIG↓CGCMspIC↓CGG
CGC↓GGGC↓C
E.XbaIT↓CTAGANheIG↓CTAGC
AGATC↓TCGATC↓G
三．填空题
1．限制酶是一类专门切割DNA的酶，它能特异性识别切割双链（单、双）DNA。
2．II型限制酶识别位点一般长度为4~6个核苷酸对。
3．个体之间DNA限制酶片段长度存在差异称限制性片段长度多态性（RFLP）。
4．限制酶命名采用Smith和Athens提议的方案，第一个字母大写取自来源细菌的属名；
第二、三个字母取自来源细菌的种名；
第四个字母（如果有）取自来源菌的株系。
5．需要部分酶切时可采取的方法有
（1）减少酶的用量
（2）缩短反应时间（3）增大反应体积。
6．限制酶识别序列为n个碱基，则其切割频率的理论值应是4n。
7．限制性内切酶通常保存在50%浓度的甘油溶液中。
8．甘油浓度是导致一些酶的星活性的原因之一，在酶切时反应体系中的甘油浓度应控制在5%以下。
9．限制与修饰是宿主的一种保护体系，它是通过对外源DNA的限制和对自身DNA的修饰来实现的。
10．II型限制酶既具有识别位点的专一性，也具有切割位点的专一性。
它作用时需要Mg2+离子作辅助因子。
四．简答题
1．在酶切缓冲液中加入牛血清白蛋白（BSA）的目的与机理是什么？
答：
目的是保护酶的活性；
机理是通过提高反应体系中蛋白质的浓度，防止内切酶失活。
2．如果用EcoRI酶切DNA时出现星活性，试分析原因？
主要原因有：
酶浓度太高；
高PH；
低盐；
含Mn2+、Cu2+等非Mg2+金属离子；
甘油浓度高于5%；
存在某些有机溶剂。
3．下列序列中哪些可能是II类限制酶的识别序列？
ATATCGCCCGGGGATATCAGCCGAGAGTC
CCCGGGGATATCGAGTC
4．用Klenow酶可将5‘粘末端填补成平末端，而导致某些限制位点消失，下列酶切后用klenow处理再连接不会丢失识别位点的是哪些？
XmaIC↓CCGGGBssHIIG↓CGCGCPstICTGCA↓G
HhaIGCG↓CHpaIIG↓CGC
BssHII,HpaII
5．当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施？
为什么？
要避免星活性及部分酶切。
（1）先用低盐缓冲液中活性最高的酶切，再补盐和第二种酶；
（2）用一种酶消化后，以酚：
氯仿：
异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将DNA重新溶解与适合第二种酶的缓冲液，加第二种酶消化；
（3）先低温酶，后高温酶；
（4）使用通用缓冲液。
6．试计算下列三种限制酶各自在某染色体DNA序列上的切割概率
Sau3AIGATCPstICTGCAGHinfIGANTC
AcyIGPuCGPyC
1/44；
1/46；
1/44；
（1/44）x（1/22）
7．一长为4.2kb的DNA片段，分别用EcoRI、PstI及EcoRI+PstI消化，电泳结果如下图所示，请根据结果绘出该片段限制性图谱
0.7kb
0.7kb0.8kb
1.5kb1.4kb2.0kb
2.0kb2.8kb
EcoRIPstIEcoRI+PstI
EcoRIPstIEcoRI
0.7kb0.7kb0.8kb2.0kb
回收与连接
一．单选题
1．用DEAE膜片法回收电泳分离的DNA片段时，在紧靠目的DNA片段前方的凝胶切一裂缝，以插入DEAE纤维素膜，该裂缝长度与DNA条带相比应（C）
A．略短B.等长C.略长D.A或B都可E.A、B、C都可
2．用透析膜插片凝胶电泳法回收DNA片段时，再区带前挖一小槽，将透析膜置于槽中，这时应注意（B）
A．透析膜要接触DNA区带一侧的胶缘。
B．透析膜不能接触DNA区带一侧的胶缘。
C．透析膜要接触DNA区带相对一侧的胶缘。
D．透析膜不能接触DNA区带相对一侧的胶缘。
E．随意插入槽中即可。
3．在回收DNA片段时，观察电泳结果为尽量减少对DNA的照射损伤应使用（A）
A．长波长紫外B.短波长紫外C.长波长红外D.短波长红外E.ABCD都不可
4．DNA回收时，如要除去EB（溴化乙锭）可用下列那种试剂（A）
A．正丁醇B.苯酚C.氯仿D.异戊醇E.乙醇
5．在DNA分子克隆时，常用到部分填补法，填补时应注意（E）
A．控制反应温度B.控制酶的反应时间C.控制DNA聚合酶的用量D.控制反应PHE.限制dNTP的种类
6．下列关于平末端连接的说法正确的是（B）
A．同等条件下连接效率高于粘末端连接的连接效率。
B．加入凝聚剂PEG8000可促进平末端连接。
C．平末端连接时反应温度要比粘末端连接温度高。
D．平末端连接方法的使用仅限于酶切后产生的两个平末端之间的连接。
E．平末端连接比粘末端连接更易产生自身环化。
7．用同一种酶切割载体和目的基因后进行连接，连接产物会含大量自身环化载体，采用下列哪种酶处理，可防止自身环化（E）
A．核酸内切酶B.核苷酸激酶C.核酸外切酶D.末端转移酶E.碱性磷酸酶
8．分子克隆中用T载体主要是与下列哪种产物连接（D）
A．单酶切产物B.双酶切产物C.同裂酶产物D.PCR产物E.酶切后形成的平末端产物
9．采用BamHI单切载体和目的基因后，进行重组连接前要（D）
A．65℃处理10分钟使BamHI灭活。
B．用碱性磷酸酶处理载体防止其自身环化。
C．电泳检测酶切结果。
D．A、B、C都正确。
E．只有A、C正确。
10．粘末端连接的优点是操作简便且（C）
A．可产生新的酶切位点B.载体易自身环化C.易于回收片段D．具有方向性E.选时更简便
二．多选题
1．重组连接时，反应体系必须的组分有（A、C）
A．Mg2+B.BSAC.ATPD.PO43-E.EDTA
2．DNA片段重组连接可用下列哪些方法（A、B、C、D、E）
A．平末端连接B.粘末端连接C.加接头连接D.同聚尾连接E.T载体连接
3．酚抽提法回收DNA片段后残余的哪些物质可能会影响连接反应（A、C）
A．酚B.微量的EBC.琼脂糖D.少量的乙酸钠E.少量的乙醇
4．产生平末端的方法主要有（A、B、E）
A．用产生平末端的限制酶切。
B．用klenow片段补齐5‘粘末端。
C．用末端转移酶补齐粘末端。
D．用Taq聚合酶补齐粘末端。
E．用S1核酸酶降解粘末端。
5．在DNA重组连接时，常采用连接头连接（linkerligation），其作用是（A、B、C、E）
A．引入某些限制酶切位点。
B.人工构建载体。
C．增加调控元件。
D.调整阅读框。
E．通过接头引入与目的基因相同的限制酶位点，并对目的基因相应酶切点进行甲基化修饰保护，可保护目的基因不受限制酶破坏。
6．构建载体时，使用双酶切相对于单酶切的优点在于（A、B、C、D）
A．避免载体自身环化B.提高连接效率C.控制外源基因的插入方向D.便于转化后的筛选E.便于修改阅读框
7．下列关于同聚物加尾法的说法正确的是（A、B、C、D、E）
A．其核心是利用末端转移酶的功能，将载体和外源DNA的3‘端再加上一端寡核苷酸。
B．不易自身环化。
C.连接效率高D.适用于CDNA克隆E．可能会产生某种限制酶切位点。
8．下列与DNA重组连接相关的说法正确的是（A、D、E）
A．不匹配的粘末端可通过部分填补后连接。
B．同聚尾法连接不仅连接效率高，也易回收插入的片段。
C．限制酶切割DNA后加入EDTA-SDS终止液抑制限制酶活性，将有利于重组连接。
D．Mg2+-ATP是T4DNA连接酶反应时的必须因素。
E．平末端连接时，在反应体系中加入适量凝聚剂可提高连接效率。
9．下列哪些因素对保证较高连接效率是有利的（A、C、D）
A．高纯度DNA。
B．载体与目的基因摩尔数之比为1：
1。
C．载体与目的基因摩尔数之比为1：
3~5。
D．连接反应体系中DNA浓度较高。
E．连接反应体系中DNA浓度较低。
10．如果DNA分子重组时，需要用平端连接，下列哪些方法可形成平末端（B、C、D、E）。
A．3‘突出的粘末端用DNA聚合酶加dNTPs填平。
B．3‘突出的粘末端用核酸酶切平。
C．5‘突出的粘末端用DNA聚合酶加dNTPs填平。
D．5‘突出的粘末端用核酸酶切平。
E．利用切口为平末端的限制酶。
三、填空题
1．形成平末端的方法有用产生平末端的限制酶切，用S1核酸酶切除粘末端，用DNA聚合酶填平粘末端。
2．载体与CDNA连接重组可用的方法有同聚尾连接酶，加人工接头连接法。
3．DNA片段重组连接时，如要克隆PCR产物，PCR产物可直接用T载体连接，而无须用限制酶处理。
4．回收DNA片段时，在确定DNA条带位置时，应使用长波长紫外灯，以最大限度减少对DNA的照射损伤。
5．回收DNA片段时，常用正丁醇处理以除去EB。
6．在用单一限制酶切载体和目的基因并进行连接时，为防止载体自身环化，常用碱性磷酸酶处理载体，或用α-互补进行筛选。
7．DNA片段重组连接的方法主要有平端连接、粘端连接、同聚尾连接、加接头连接。
1．如何将一平末端的DNA片段与BamHI形成的粘末端连接？
使用加接头连接法。
人工合成一段含BamHI酶切位点的DNA短片段，然后与该平末端片段两端连起来，用BamHI切割连接片段，即可形成BamHI的粘末端。
2．什么是同聚尾连接法？
具有哪些优缺点？
同聚尾连接法是利用末端转移酶在载体和外源DNA的3‘端各加上一段互补的寡聚核苷酸，形成人工粘性末端，然后在DNA连接酶的作用下，连接成重组DNA。
其优点在于
（1）由于同一DNA两端粘尾相同，不会自身环化；
（2）连接效率高；
（3）用任何一种方法制备的DNA都可用这种方法连接。
其缺点在于
（1）方法复杂；
（2）外源片段较难回收；
（3）由于添加了同聚尾，可能会影响外源基因表达。
3．什么是接头连接法？
人工合成或来源于某一质粒的小段含某限制酶位点的DNA与载体或外源DNA分子相连，这样便在载体或外源DNA上制造出新的酶切位点，即接头连接。
4．为什么用同裂酶进行体外重组效率最高？
同裂酶是指来源不同的限制酶切割DNA后，产生相同的末端。
多数同裂酶产生的粘性末端并非完全一致而是有四个碱基相同，这样用同裂酶切割载体和目的基因后的连接产物常会失去原有的限制酶位点，这样用同裂酶进行重组时，限制酶切割反应后不用将该酶失活，即可直接进行重组连接，由于连接体系中原有限制酶存在，载体自连不会发生，从而保证了载体只同外源DNA的连接。
1．下列哪种DNA结构在转化时能获得最高转化效率（）
A．线形双链DNAB.单链线形DNAC.完整的环状双链DNAD．开口环状双链DNAE.A和C
2．下列表型中，哪种是基因工程上的理想的受体菌表型（B）
A.r+m+rec+B.r-m-rec-C.r-m+rec+D.r+m+rec-E.r-m-rec+
3．大肠杆菌出现感受态的生理期是（B）
A．潜伏期B.对数期C.对数后期D.平衡期E.衰亡期
4．CaCl2法制备E.coli感受态细胞时，摄入ＤＮＡ温度是（E）
A．0℃B.16℃C.37℃D.25℃E.42℃
5．关于感受态细胞的下列说法不正确的是（C）
A．有人工感受态细胞和自然感受态细胞。
B．具有可诱导性。
C．有可转移性。
D．不同种细菌出现感受态的生理时期不同。
E．不同种细菌出现感受态的比例不同。
1．CaCl2诱导E.coli感受态细胞时，下列哪些因素会影响转化效率（A、B、C、D、E）
A．Ca2+浓度B.DNA纯度与构象C.DMSOD.温度E.PH
2．人工诱导感受态细胞，下列方法哪些正确（A、B、C、D）
A．CaCl2处理B.核酸酶抑制法C.饥饿法D.PEG处理E.DMSO
3．下列有关利用粘尾质粒将外源DNA导入E.coli中的说法正确的是（B、C、D、E）
A．空cosmid质粒可直接体外包装导入E.coli，也可用CaCl2法导入E.coli。
B．Cosmid/DNA与头部蛋白、尾部蛋白混合，体外包装后可进入E.coli。
C．Cosmid虽然只有4~6kb,但可容纳约40~50kb的外源DNA。
D．Cos序列是DNA包装到λ噬菌体颗粒中所需的DNA序列。
E．Cosmid/DNA重组体包装后以双链线性分子形式导入E.coli。
4．下列有关λDNA重组体导入E.coli说法正确的是（A、B、C）
A．λDNA重组体必须有效包装后才能有感染E.coli的活性。
B．λDNA重组体包装要有头部蛋白、尾部蛋白的参与。
C．λDNA重组体包装长度为野生型λDNA的75~105%。
D．λDNA重组体是以双链环状形式导入E.coli。
E．λDNA重组体用CaCl2法导入E.coli也能取得高转化率。
5．下列关于CaCl2处理获得感受态方法的说法正确的是（A、B、C、D）
A．DNA与Ca2+结合后吸附在细胞表面，该复合物可抵抗细胞表面的DNAase作用。
B．DNA—Ca2+在0℃时吸附于细胞表面，温度高或温度波动会大大降低转化效率。
C．有可能将两种质粒转入同一细胞但最终选择板上的菌落只含一种质粒。
D．42℃热休克是为了让DNA进入感受态细胞。
E．热休克后要37℃温育1小时，目的是使含有外源DNA的细胞分裂1~2代，更易筛到重组子。
1．感受态细胞是指具有摄取外源DNA分子能力的细胞。
2．λ噬菌体蛋白对重组DNA体外包装时，包装长度为野生型λDNA的75~105%。
3．感受态大肠杆菌细胞在温度为0℃时吸附DNA，42℃时摄入DNA。
4．CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，DNA以DNA-Ca2+复合物形式吸附于细胞表面。
5．基因工程受体菌的基因型常为r-m-rec-,r-表示限制缺陷型，m-表示修饰缺陷型，rec-表示重组缺陷型。
6．CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，热休克的温度是42℃。
7．E.coli感受态出现的生理时期是对数期。
1．简述在CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，影响转化效率的各种因素。
影响因素有：
Ca2+浓度、PH值、感受态细胞活力、DNA浓度、DNA纯度和构象、温度、DMSO处理、还原剂处理、氯化六氨合高钴处理。
2．CaCl2法制备感受态细胞转化DNA时，低温的主要目的是什么？
热休克温度和目的是什么？
低温目的：
（1）抑制细胞的旺盛生理代谢；
（2）有助于DNA—Ca2+吸附于细胞表面；
（3）防止DNAase降解DNA。
热休克温度是42℃；
目的是使细胞摄入吸附于其表面的DNA。
3．简述利用Cosmid将外源DNA导入E.co
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