浅谈化学消毒的中和剂对水中内毒素活性检测的影响Word下载.docx

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　　1.1玻璃器皿

　　无热原稀释试管（15mm×

100mm）、无热原反应试管（8mm×

75mm）和无热原移液器吸头购买自湛江安度斯生物公司.其他玻璃器皿经铬酸浸泡24h，热自来水冲洗，超纯水冲洗，马弗炉干烘350～400℃2h去除热原.

　　1.2仪器与试剂

　　内毒素定量检测采用ATI320-06动态试管仪及配套软件（LabKinetic公司，英国）.pH值测定采用Pb-21酸度计（Sartorius公司，德国）.Mill-Q纯水机（Millipore公司，美国）.另外，还需要涡旋混合器、马弗炉、移液器.动态浊度法鲎试剂（最低检测限0.03EU·

mL-1）、无热原检查用水（<

0.003EU·

mL-1）和无热原Tris-HCl（pH7.4）缓冲溶液购买自湛江安度斯生物公司.内毒素工作标准品（controlstandardendotoxin，CSE，批号150601，每支90EU）购买自中国药品生物制品检定所（北京）.生物化学试剂如抗坏血酸、Na2SO3和Na2S2O3为分析纯，组氨酸、甘氨酸和吐温80购买自Sigma公司.

　　1.3动态浊度法鲎试验检测内毒素活性

　　采用动态浊度鲎试验定量检测内毒素活性，将0.1mL鲎试剂加入反应管，加入0.1mL样品混合均匀，立即放入ATI320-06动态试管仪进行检测.样品和鲎试剂在37℃温育条件下发生凝集反应，ATI320-06动态试管仪及软件生成每个样品的反应动态曲线，记录反应试管在波长405nm处达到95%透光率的达限时间.样品的达限时间和所含内毒素活性负相关，根据标准曲线来确定样品内毒素活性.每个样品采用2个平行样，并以0.1EU·

mL-1CSE溶液作为阳性对照，记录回收率、稀释倍数、达限时间等其他参数.样品测试3次取均值.试验结果应满足以下条件:

①标准曲线中阴性对照的达限时间长于最低活性（0.03125EU·

mL-1）的达限时间.②标准曲线相关系数R大于0.98.③平行样的变异系数不得大于10%.④根据药典规定，加标回收率在50%～200%之间认为稀释倍数合适，没有明显的干扰.

　　1.4内毒素检测的干扰试验

（1）CSE溶液的配制打开CSE（每支90EU），向安瓿瓶内加1mL无热原检查用水配制成90EU·

mL-1的CSE溶液，密封后采用涡旋混合15min.将CSE溶液转移至无热原玻璃容器，加无热原检查用水稀释成0～2EU·

mL-1的CSE溶液.

（2）0～1.0%浓度的中和剂对鲎试验的影响

　　采用无热原检查用水，将组氨酸、甘氨酸、抗坏血酸、吐温80、亚硫酸钠（碱性）和硫代硫酸钠配制成浓度0、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%和10.0%的中和剂溶液.此外，采用无热原Tris-HCl（pH7.4）缓冲溶液配制浓度分别为0、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%和10.0%的亚硫酸钠（中性）溶液.将已配制的不同浓度中和剂溶液按1∶9的比例添加至0～2EU·

mL-1的CSE溶液中，检测组氨酸、甘氨酸、抗坏血酸、吐温80、亚硫酸钠（碱性）、亚硫酸钠（中性）和硫代硫酸钠浓度分别在0、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%和1.0%情况下内毒素活性的变化.

　　（3）0～5.0%浓度的硫代硫酸钠对鲎试验的影

　　响将硫代硫酸钠加无热原检查用水溶解，配制成0、2.5%、5.0%、10.0%、15.0%、20.0%和25.0%的硫代硫酸钠溶液.将已配制的硫代硫酸钠溶液按1∶4的比例添加至0～2EU·

mL-1的CSE溶液中，检测硫代硫酸钠浓度分别在0、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%情况下内毒素活性的变化.

　　2结果与分析

　　2.1常用的有机类中和剂对鲎试验结果的影响

　　组氨酸、甘氨酸、抗坏血酸和吐温80是常用的有机类中和剂，在0～1.0%的浓度范围对动态浊度法鲎试验的干扰结果.结果表明，甘氨酸对内毒素活性的检测未见明显干扰，组氨酸、抗坏血酸和吐温80对检测结果均有不同程度的影响，干扰程度详.其中，0～1.0%浓度的组氨酸对内毒素活性的定量检测引起强烈的增强效果;

抗坏血酸引起显著的抑制效果;

吐温80引起明显的抑制作用.甘氨酸和组氨酸等氨基酸类用来中和醛类消毒剂.由于组氨酸是类内毒素物质，可以引起内毒素的聚集和吸附，严重影响光度法鲎试验的光度值，导致检测结果的增强.当组氨酸浓度从0提高至0.05%时，检测结果从初始内毒素活性0.38EU·

mL-1增高至0.95EU·

mL-1，增强率达到150%;

当组氨酸浓度从0.05%提高至0.5%时，内毒素活性提高至3.30EU·

mL-1，增强率达到768%.0～1.0%浓度的甘氨酸对鲎试验结果基本无明显干扰.检测结果表明当甘氨酸浓度从0提高至1.0%时，初始内毒素活性1.22EU·

mL-1增高至1.39EU·

mL-1，增强率仅为14%.但是，甘氨酸和戊二醛的中和产物显黄色，会对光度法鲎试验（浊度法和显色法）产生严重干扰，因此在光度法鲎试验中，甘氨酸不适于做戊二醛的中和剂使用.吐温80是常用的中和剂，可以和卵磷脂配伍用于清除吸附力较强的离子型消毒剂如季铵盐类和酚类.0～1.0%浓度的吐温80对内毒素检测引起明显的抑制效果.当吐温80浓度从0提高至1.0%时，检测结果从初始内毒素活性1.18EU·

mL-1降低至0.69EU·

mL-1，抑制率为41%.抗坏血酸是常用的抗氧化剂，可以用作卤素消毒的中和剂.0～1.0%浓度的抗坏血酸对鲎试验结果引起显著的抑制效果.当抗坏血酸浓度从0%提高至0.05%，检测结果从初始内毒素活性1.23EU·

mL-1降低至0.70EU·

mL-1，抑制率达到43%;

当抗坏血酸浓度提高至1.0%时，内毒素活性降低至0.34EU·

mL-1，抑制率达到72%.抗坏血酸的酸性强，向样品中添加会导致内毒素的酸解或者对鲎试剂酶活性造成破坏，抑制鲎试验的反应并影响检测结果.

　　2.2常用无机类中和剂对鲎试验结果的影响

　　亚硫酸钠和硫代硫酸钠是常用的无机类中和剂，其在0～1.0%的浓度范围对动态浊度法.亚硫酸钠是卤素和醛类消毒剂的中和剂，由于亚硫酸钠的碱性强，使用时分为碱性和中性两种情况.0～1.0%浓度的亚硫酸钠（碱性）对内毒素检测有明显的增强效果.当亚硫酸钠（碱性）浓度从0提高至1.0%时，检测结果从初始内毒素活性1.08EU·

mL-1增高至1.50EU·

mL-1，增强率为39%.亚硫酸钠（碱性）对鲎试验有增强效果，这是因为鲎试剂中含有一定数量的Ca2+和Mg2+用来保持试剂的分散性，OH-的增多会影响Ca2+和Mg2+的状态，导致鲎试剂分散性差，引起反应产物聚集导致增强结果.0～1.0%浓度的亚硫酸钠（中性）对内毒素检测引起显著的抑制作用.亚硫酸钠（中性）浓度从0提高至1.0%时，检测结果从初始内毒素活性1.08EU·

mL-1降低至0.38EU·

mL-1，抑制率为65%.虽然亚硫酸钠在调节pH值至中性后，可以消除水样的碱度带来的干扰，但是添加的H+和SO2-3生成的HSO-3破坏鲎试剂中酶的活性，对鲎试验有抑制效果.硫代硫酸钠是卤素类消毒剂、汞制剂及过氧乙酸等的中和剂.0～1.0%浓度的硫代硫酸钠对鲎试验结果基本无明显干扰，当硫代硫酸钠浓度从0提高至1.0%时，内毒素活性从初始值1.08EU·

mL-1降低为1.01EU·

mL-1，抑制率仅为6.5%.但是当硫代硫酸钠浓度提高至1.0%～5.0%时，对内毒素检测结果有明显的抑制效果.因此，低浓度的硫代硫酸钠溶液适于在鲎试验之前作为消毒剂的中和剂，但是浓度应该控制在0.5%以内.

　　3结论

（1）在0～1.0%浓度范围内，除甘氨酸和硫代硫酸钠之外，组氨酸、抗坏血酸、吐温80和亚硫酸钠（中性和碱性）对内毒素检测结果均有不同程度的干扰.

（2）组氨酸对内毒素活性的定量检测有强烈的增强效果;

吐温80引起明显的抑制效果;

亚硫酸钠（碱性）引起明显的增强效果;

亚硫酸钠（中性）有显著的抑制效果.

　　（3）此外，0～1.0%浓度的甘氨酸对内毒素检测基本无明显干扰，但是甘氨酸和戊二醛的中和产物呈黄色，当作为戊二醛的中和剂使用时会对光度法鲎试验的结果产生干扰.0～1.0%浓度的硫代硫酸钠对鲎试验结果基本无明显干扰，但是高浓度的硫代硫酸钠（1.0%～5.0%）会对鲎试验引起明显的抑制效果.

　　（4）与组氨酸、甘氨酸、抗坏血酸、吐温80和亚硫酸钠相比，硫代硫酸钠更适合在鲎试验之前用作中和剂，但是浓度应控制在0.5%范围以内.此外，有些消毒措施不适合选择硫代硫酸钠作为中和剂，需进一步筛选出对鲎试验无明显干扰的其他中和剂，避免使用组氨酸、抗坏血酸、吐温80和亚硫酸钠这类对鲎试验有干扰的中和剂.