DNA的分离纯化与测定.docx

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DNA的分离纯化与测定

第一章DNA的分离、纯化及测定

第一节DNA的提取

一、提取程序的原理

植物DNA的提取程序应包括以下几项；

1，破碎（或消化）细胞壁释放出细胞内容物。

然而许多操作在破壁的同时也会剪切DNA，因此任何方法都是在DNA的完整性和产量这两个方面之间折衷考虑的结果。

分离总基因组DNA常用的破壁方法

是将植物组织胀水，然后研磨成细粉，

或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉。

分离核DNA或细胞器DNA时则应采取较为温和的破壁方法，以免过早破坏内膜系统，人们通常采用在含有渗透剂的缓冲液中4oC匀浆的方法来破壁。

2、破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中。

这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。

去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。

通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子——镁离子。

3、去除RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质

一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。

剧烈振荡或小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。

一般说来，如果操作得当，可以得到相对分子质量长度为50—l00kb的DNA。

在DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。

大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RNaseA除去。

但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，常常使DNA提取物呈胶状，更为重要的是即使是低浓度情况下它们也会干扰后续操作，如抑制某些DNA修饰酶包括限制性内切酶的活性，从而阻碍Southern杂交或基因克隆；同时多糖杂质还会影响分光光度法对核酸的定量分析等。

（植物分子生物学----实验手册（英）ClarkeM.S.主编顾红雅瞿礼嘉主译高等教育出版社1998）

二、基因组DNA的提取

1、基因组DNA用途

DNA是遗传信息的载体，是重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象。

为了进行测序,Southern杂交|,基因文库的构建，PCR扩增等，高分子量和高纯度的基因组

DNA是非常重要的前提.

2、基因组DNA提取的原则

保证提取的DNA具有一定的长度

纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质

排除有机溶剂和金属离子的污染

蛋白质,多糖,脂类等降低到最低程度

排除其他核酸分子的污染

3、基因组DNA-CTAB法

CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）

CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵）,是一种阳离子去污

剂,具有从低离子强度（0.3mol/LNaCl）溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性,在高离子强

度的溶液中（>0.7mol/LNaCl）,CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过

有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来

CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl（三（羟甲基）氨基甲烷）（pH8.0）提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;

NaCl提供一个高盐环境,使DNA充分溶解,存在于液相中;

CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;

β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除

CTAB提取缓冲液的改进配方

PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.

（Fromwebmodified）

方法1

——液氮

——1×缓冲液：

50mmol/LTris-HClpH8.0,

0.7mol/LNaCl,

10mmol/LEDTApH8.0,

1%CTAB,

20mmol/L2-巯基乙醇（用前加入）

——氯仿/异戊醇（24：

1）

——RNaseA:

2000U/mL用0.15mol/LNaCl,0.015mol/L柠檬酸三钠配10mg/mL;使用前100℃热处理15min,除去残留的DNase活性

——异丙醇，

——76%乙醇，0.2mol/L乙酸钠

——70%乙醇

——TE缓冲液:

10mmol/LTris-HCl1mmol/LEDTApH8.0,

操作程序

1.向装有700~800mg磨碎的干燥植物组织（冰冻干燥法，或用食品脱水器45℃~55℃用温暖干燥的气流对植物组织处理12h以上）（最好是去淀粉处理的：

收获之前将植株暗处理24h）的50mL聚丙烯离心管中加入20mL65℃预热的

1×CTAB提取缓冲液。

轻轻转动离心管使植物组织在提取缓冲液中均匀分散，

65℃温育90min,并不时轻轻转动离心管。

或者，将10g经去淀粉处理的新鲜植物材料用液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，在化冻之前将粉末转移至一50mL聚丙烯离心管中，然后加入20mL预热至90℃的2×CTAB提取缓冲液（CTAB在低于15℃时会析出沉淀，因此在将其加入到冷冻的材料中之前必须预热）。

轻轻转动离心管，混匀，然后置于65℃温育90min。

2．混合物冷至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇。

轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液。

室温下5000g离心10min分相。

3．将上清液（水相）转移至一干净离心管中，加入1/100体积RNaseA贮液，颠倒混匀37℃保温30min。

4．加入0.7体积异丙醇，仔细混匀，室温放置15min沉淀DNA。

5．用一玻璃钩将DNA钩出（最适条件下，DNA-CTAB沉淀呈白色纤维状，很易钩出，若有多糖等杂质时呈絮状或胶状，需离心得到DNA-CTAB沉淀；2%W/VPVP聚乙烯吡咯烷酮有助于去除多酚类杂质），并转移至一装有5mL76%乙醇，0.2mol/L乙酸钠的干净离心管中，冰上放置20min，然后转移至一装有5mL76%乙醇的离心管中冰上旋转5min。

6．将DNA转移至一干净离心管中，空气干燥15min，溶于尽可能少的TE缓冲液中（5mL左右）。

若要使DNA样品加速溶解并除去其中残留的DNase活性，可置于

65℃水浴加热10min。

4℃贮存。

（植物分子生物学----实验手册（英）ClarkeM.S.主编顾红雅瞿礼嘉主译高等教育出版社1998）

方法2

CTAB（CetylTrimethylAmmoniumBromide十六烷基三甲基溴化铵））是一种去污剂．它能跟核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液（0.7mol/LNaCl）中可溶并且稳定存在、但如果降低盐的浓度（0.3mol/LNaCl），CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来。

而大部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中，通过离心将CTAB-核酸沉淀下来，然后溶于高盐溶液中，最后通过CsCl离心去除所有蛋白、多糖、寡聚核苷酸等不纯物。

抽提缓冲液（2×）

CTAB（W/V）2%

Tris-HCl（pH8.0）100mmol/l

EDTA20mmol/l

NaCl1.4mol/l

巯基乙醇2%

10%CTAB溶液

NaCl0.7mol/l

CTAB10%

沉淀缓冲液

CTAB1%

Tris-HCl（pH8.0）50mmol/l

EDTA10mmol/l

巯基乙醇1%

CsCl梯度溶液（每梯度）

CsCl25g

TE缓冲液（pH8.0）25ml

溴化乙锭（（EB）5mg/ml

TE缓冲液:

Tris-HCl（pH8.0）10mmol/L

EDTA1mmol/L

异丙醇溶液：

向装有一定量异丙醇的瓶中加入TE缓冲液直至两相出现，然后边搅拌边加入固体CsCl，至下层TE相中出现白色沉淀，两相均匀待用

液氮

氯仿/异戊醇（24/1）

异丙醇

2%巯基乙醇

氯仿还能加速有机相与液相分层。

去除植物色素和蔗糖．在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。

最后用氯仿抽提处理，是为了去除核酸溶液中的迹量酚。

实验程序

（1）取10g~50g新鲜植物材料，先置液氮中速冻半分钟，转至研钵中研磨成细粉末。

（2）将细粉末转至一个250ml的离心管中，先加入10~50ml的2%巯基乙醇，再加等体积的煮沸的抽提缓冲液（2×），迅速混匀。

（3）将离心管置55℃水浴中保温，可轻轻搅动混合物，使离心管内温度达到50℃，然后让混合物降至室温。

（4）加等体积的氯仿/异戊醇（24/1），轻缓地颠倒混匀，室温下12000g离心10分钟，上清转至另一新离心管中。

（5）向离心管中加入1/10体积的10%CTAB溶液，再重复第4步一次。

（6）向离心管中加入等体积的沉淀缓冲液，混匀，室温下放置至少30分钟，4000g离心10分钟，小心去上清，加CsCl梯度溶液，在50℃水浴中用枪头轻缓搅溶沉淀。

（7）将梯度溶液上到超速离心管中，平衡后封好管，在20℃，50000g条件离心过夜。

（8）在紫外灯下转移DNA带至一离心管中，加入等体积的异丙醇溶液，轻轻混匀后静置，分层后弃上层；重复抽提几次，直至紫红色消失。

（9）加两倍体积的TE缓冲液，混匀后加等体积的异丙醇，-20℃放置1小时，4℃条件下12000g离心30分钟，沉淀溶于TE缓冲液中。

（10）向其中加入1/5体积的3mol/lNaAc（pH6.0）和3/5体积的异丙醇，混匀，在室温下放置5~10分钟，离心后沉淀溶于适量TE缓冲液中。

（11）用紫外分光光度仪检测DNA含量。

（8）是去除EB,异丙醇溶液也可用氯化钠饱和。

CTAB法提取真菌基因组DNA

2×CTAB提取缓冲液（使用前在55or65oC预热）

2%（w/v）CTAB（HexadecyltrimethylammoniumBromide,Sigma#H-5882

=cetyltrimethylammoniumbromide）

100mMTris-HCl（pH8.0）

20mMEDTA（pH8.0）

1.4MNaCl

optional:

add1%mercaptoethanolbeforeusing（IusuallydonoaddMCE）

1取干菌丝（–80oC保存）放入研钵，加液氮后，研磨成粉末。

2将粉末转到离心管中，加入2×CTAB提取缓冲液（使用前在55or65oC预热）。

（1g加20ml）。

365oC保温30min

4加入等体积氯仿：

异戊醇（24:

1），混匀，轻轻转动20min。

54,000rpm离心5min.

6取上清液于另一离心管，加RNaseA（5-50μg/ml）37oC保温30-60min。

7加入酚：

氯仿（1:

1），轻轻来回颠倒5min.

84,000rpm离心5min.4oC。

9加入等体积氯仿：

异戊醇（24:

1），轻轻转动5min。

10取上清液于另一离心管，加入2倍体积100%乙醇或0.6-1×异丙醇。

1110,000rpm离心10min.4oC

12.5-10ml70%乙醇洗一次。

13风干DNA，用DDWorTE缓冲液溶解。

三、细胞核、线