限制性内切酶综合资料Word文件下载.docx
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这样，限制性内切酶和它的"
搭档"
--甲基化酶一起就构成了限制-修饰（R-M）系统。
在一些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，它们各自独立行使自己的功能；
而在另一些系统中，两种功能由同一种限制-修饰酶的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执行。
传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。
然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则应当远远不止这三种。
I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。
它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链。
以前人们认为I型限制性内切酶很稀有，但现在通过对基因组测序的结果发现这一类酶其实很常见；
尽管I型酶在生化研究中很有意义，但由于不产生确定的限制片段和明确的跑胶条带，因而不具备实用性。
II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。
它们产生确定的限制片段和跑胶条带，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。
II型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。
实际上，从已知的情况上看，这些酶很可能是在进化过程中各自独立产生的，而非来源于同一个祖先。
II型限制性内切酶中最普遍的是象HhaI、HindIII和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。
这一类酶是构成商业化酶的主要部分。
大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；
但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。
一些酶识别连续的序列（如EcoRI识别GAATTC）；
而另一些识别不连续的序列（如BglI识别GCCNNNNNGGC）。
限制性内切酶的切割后产生一个3'
羟基端和一个5'
磷酸基团。
它们的活性要求镁离子，而相应的修饰酶则需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。
这些酶一般都比较小，亚基一般都在200-300个氨基酸左右。
另一种比较常见的酶是所谓的IIS型酶，比如FokI和AlwI，它们在识别位点之外切开DNA。
这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右；
它们识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。
一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。
因此一些IIS型的酶在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可能更高。
第三种II型限制性内切酶（有时也被称为IV型限制性内切酶）是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同时具有限制和修饰酶活性。
有些酶识别连续序列，并在识别位点的一端切开DNA链；
而另一些酶识别不连续的序列（如BcgI：
CGANNNNNNTGC），并在识别位点的两端切开DNA链，产生一小段含识别序列的片段。
这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。
他们在N端由一个负责切开DNA的功能域，这个域又与DNA修饰域连接；
此外还有一到两个识别特异DNA序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。
当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。
III型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种功能的酶。
它们在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列；
它们很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。
酶切反应
（SettingUpaRestrictionEndonucleaseReaction）
一、建立一个标准的酶切反应
目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1XNEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。
如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；
如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。
二、选择正确的酶
不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。
识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。
假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；
而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。
内切酶的产物可以是粘端的（3'
或5'
突出端），也可以是平端的片段。
粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。
相关信息参见目录的CompatibleCohesiveEndsAndRecleavableBluntEnds一文。
三、酶
内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
酶的用量视在底物上的切割频率而定。
例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。
参见目录第244和264之"
切割质粒DNA"
和"
包埋法切割DNA"
。
四、DNA
待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。
DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。
关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。
五、缓冲液
对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。
使用时的缓冲液浓度应为1X。
有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。
在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/ml）。
不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。
关于缓冲液更详细的信息参见第234页。
六、反应体积
内切酶活力单位的定义是：
1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。
因此酶：
DNA的反应比例可以由此确定。
较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。
为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。
七、混合
这是非常重要然而常常被忽略的一步。
想要反应完全，必须使反应液充分混合。
我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。
注意：
不可振荡！
八、反应温度
大部分酶的反应温度为37°
C；
从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。
一般为50-65°
C不等。
参看第244页Activityofthermophilesat37°
C。
九、反应时间
1酶活单位的定义时间为1小时。
如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；
反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。
参见第241页酶在反应中的存活时间。
十、终止反应
如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。
在NEB我们使用如下反应终止液：
50%的甘油，50mMEDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。
如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65°
C或85°
C，20分钟）。
热失活并不能适用于所有的酶，详情参见第240页热失活表。
此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。
十一、贮存
大部分酶应贮存于-20°
少部分酶则须在-70°
C长期保存。
详情请参见相关酶的DATASHEET或目录相关部分。
10XBUFFER和100XBSA于-20°
C保存。
BSA不能与NEBuffer混合后保存，否则将会出现BSA沉淀。
十二、稳定性
每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；
最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。
通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20°
C条件下十分稳定。
高于-20°
C条件下稳定性将有所降低。
十三、对照反应
如果发现您的DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。
具体方法如下：
将不加内切酶的底物DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。
若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；
若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。
如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则混合物里的对照DNA也无法被切开。
限制性内切酶质量控制
QualityControl）
单位定义
限制性内切酶的一个活性单位是指，在50μl的反应体系里，采用随酶提供的NEBuffer，用1个小时的时间，彻底消化1μg底物DNA所需要的酶量。
酶切反应应在带盖的Eppendorf管中进行，选用技术数据卡上所标明的适宜温度。
在确定酶活性之前，浓缩的酶应该用推荐的贮存液稀释成大约1,000单位/ml。
质量控制
所有质量控制鉴定结果都公布在随酶提供的技术数据卡上。
非特异性内切酶鉴定
为鉴定非特异性内切酶污染，限制性内切酶与缺少该酶识别序列的超螺旋DNA底物温育。
对于RFI型DNA（超螺旋形式），一个单一的非特异性缺口就会将它转变成RFII型DNA（带缺口环状）。
小份的限制性内切酶与1μgDNA在50μl反应体系中，采用推荐的NEBuffer，在推荐的温度下温育4小时。
两种形式的DNA在琼脂糖凝胶上很容易区分，可以计算出从RFI到RFII的转化率。
核酸酶污染的过夜鉴定
所有的限制性内切酶与1μg底物DNA在50μl反应体系中，采用推荐的NEBuffer温育过夜。
比较酶切1小时的特征带型和过夜酶切的带型。
如果两种情况下带型均明显、没有改变，则说明测试的酶中不存在非特异性的DNA酶。
我们报道了可以温育过夜的最大酶单位数。
核酸外切酶污染鉴定
所有的限制性内切酶与1μg单双链混合的、3H标记的E.coliDNA（200,000cpm/μg）在50μl反应体系中，采用随酶提供的NEBuffer，在推荐的温度下温育4小时。
通过可溶解的TCA着色，可以计算出反应体系中被标记的DAN的百分比，进而可以显示出核酸外切酶的污染。
该种方法可检测出的底线是0.05%。
DNA片段的连接
DNA片段通过用每一种限制性内切酶过量消化底物DNA而获得。
这些片段随后用T4DNA连接酶连接（5′末端浓度为0.1-1.0μM）。
连接的片段然后用同一种限制性内切酶重切。
仅当3′和5′末端都保留完整，连接反应才会发生；
而且只有那些识别位点完全恢复的分子才能被重切。
切割后正常的带型说明3′和5′末端都是完整的，而且准备的酶样品中检测不到核酸外切酶和磷酸酶。
采用PstI的一个例子显示如下：
蓝白斑筛选鉴定
用于克隆的酶还须通过额外的质量鉴定――蓝白斑筛选鉴定，以确定经酶过量消化后DNA末端的完整性。
该种鉴定方法为：
用酶10倍过量消化适当的载体上lacZ基因中单一的酶切位点，连接，转化，并涂XGal/IPTG/Amp平板。
成功地切割、连接和表达b-galactosidase可以说明克隆后基因是完整的，一个完整的基因产生蓝斑，一个不完整的基因（例如，降解的DNA末端）产生白斑。
在进行蓝白斑鉴定中，所有的限制性内切酶产生的白斑数量不应超过3％。
限制酶在各种NEBuffer中的活性
（NEBufferActivityChartforRestrictionEnzymes）
对应每一种限制性内切酶，NewEnglandBiolabs均提供彩色盖子的10XNEBuffer，以保证100%活性。
下面表格中列出每一种酶及其随酶提供的最适宜的NEBuffer。
同时也列出每种酶在四种不同的NEBuffer中的大致活性，以帮助选择双酶切时最适宜的环境。
除非特别指出，温育温度均为37°
注意事项：
表格中所列出的酶活性是近似值，计算酶活性时所采用的底物与计算该酶的单位时所采用的底物相同。
缓冲液在使用前应充分解冻，并混合均匀。
点击英文缩写注解与缓冲液成份.
|A|B|C|D|E|F|H|K|M|N|P|R|S|T|X|Z|
Enzyme
Supplied
NEBuffer
%ActivityinNEBuffers
1
2
3
4
AatII
50
100
AccI
10
Acc65I
3+BSA
75
25
AciI
AclI
4+BSA
AfeI*
SE-Y
AflII
2+BSA
AflIII
AgeI
AhdI
AleI
20
AluI
AlwI
AlwNI
ApaI@25°
C
ApaLI
ApoI@50°
AscI
AseI
NR
dd100
AsiSI
AvaI
AvaII
AvrII
BaeI@25°
2+BSA+SAM
BamHI
Udd+BSA
BanI
BanII
BbsI
BbvI
2
BbvCI
BceAI
BcgI
U+SAM
BciVI
BclI@50°
BfaI
BfrBI
BfuAI@50°
BfuCI
BglI
BglII
BlpI
Bme1580I
BmgBI
BmrI
BmtI*
SE-W
BpmI
Bpu10I*
SE-K
BpuEI@25°
2+SAM
BsaI@50°
BsaAI
BsaBI@60°
BsaHI
BsaJI@60°
BsaWI@60°
BsaXI
75
100
10
BseRI
BseYI
BsgI
4+SAM
BsiEI@60°
BsiHKAI@65°
BsiWI@55°
BslI@55°
BsmI@65°
BsmAI@55°
BsmBI@55°
BsmFI@65°
BsoBI@65°
Bsp1286I
BspCNI@25°
1+BSA+SAM
BspDI
BspEI
BspHI
BspMI
BsrI@65°
BsrBI
BsrDI@60°
BsrFI
U
BsrGI
BssHII@50°
BssKI@60°
BssSI
BstAPI*@60°
BstBI@65°
4
BstEII@60°
BstF5I*@65°
BstNI@60°
BstUI@60°
BstXI@55°
BstYI@60°
BstZ17I
Bsu36I
BtgI
BtsII
4+BSA
50
Cac8I
ClaI
DdeI
DpnI
DpnII
DraI
DraIII
DrdI
EaeI
EagI
EarI
EciI
EcoNI
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