微生物与制药综述Word格式.docx
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从传统工艺,如利用发酵工程生产抗生素、酶制剂以及B-胡萝卜素等;
到现今利用转基因技术生产干扰素、胰岛素、生长因子等几十种新药和疫苗。
本文着重综述了微生物发酵工程在医药研究和生产中应用最近进展,主要包括生产维生素、多价不饱和脂肪酸、抗生素、抗癌物质医用酶制剂等五个方面。
2.研究内容
2.1.微生物生产维生素
维生素是六大生命要素之一,为整个生命活动所必需。
β-胡萝卜素、VC、VE是目前应用最为广泛,效果最为显著三种维生素,它们作用分别是:
β-胡萝卜素是强力抗氧化剂,有抑制癌细胞增殖和提高机体免疫力等作用。
VC和VE均是抗氧化剂,前者可阻止、破坏自由基形成,还具有激活免疫系统细胞活力,刺激机体产生干扰素以抵御外来侵染因子。
至于VE可产生抗体,增强机体免疫力。
目前,上述“三素”以实现了微生物工业化生产。
目前,β-胡萝卜素主要是由三孢布拉霉菌生产,在1998年,陈涛等[1]已经针对三孢布拉霉菌特点,优化发酵工艺,在3M3发酵罐中发酵120h,生产β-胡萝卜素产量已达到1146.5mg/L。
虽然,传统工艺生产β-胡萝卜素产量高,生产周期比较短,但是传统工艺复杂,成本过高,不利于大规模工业化生产。
故,目前许多课题组专注于开发新生产β-胡萝卜素菌种或改进传统工艺。
据近年所发表期刊文献,目前,采用红酵母发酵生产β-胡萝卜素是一种工艺简单,成本低廉方法,虽然在产量方面较传统方法低很多,但是该方法仍具有很大发展潜力。
何海燕等[2]采用粘红酵母R3-35摇瓶发酵84h,生产β-胡萝卜素到达12.21mg/L。
胡萍等[3]采用酵红酵母Yh3发酵生产β-胡萝卜素,其生物量及色素产量最大值分别为9.89mg/L和10.38mg/L。
目前,工业生产VC采用二次发酵法,此法是在70年代初研究出来,属于我国首创,其先进性得到国际公认。
该法[4]以D-山梨醇为底物,用生黑醋杆菌发酵生产L-山梨糖,再采用假单胞菌发酵生产2-酮-L-古洛糖酸,最后通过化学转化生成维生素C,可达到产量130.92g/L。
此后,国内外纷纷展开从D-葡萄糖串联发酵生产2-酮-L-古洛糖酸新研究。
伊光琳等[5]采用欧文氏菌和棒状杆菌从D-葡萄糖经中间体2,5-二酮-D-葡萄糖串联发酵生成2-酮-L-古洛糖酸获得成功,可达到产量106.3g/L。
Anderson等[6]应用DNA重组技术使棒状杆菌2,5-二酮-D-葡萄糖酸还原酶基因在欧文氏菌中表达,构建基因工程菌直接一部转化D-葡萄糖为2-酮-L-古洛糖酸。
目前,维生素E主要是通过天然植物提取或精炼植物油生产,该工艺已经成熟,维生素E产量也是众多维生素中发展最快,1997年,世界天然维生素E产量约为3500t,2000年约为5300t[7]。
由于高等植物作为维生素E总含量低,高活性形式α-生育酚比例也低,近年来,许多科学家把目光投向微生物生产生育酚。
微生物是天然生育酚很好来源,然而只有微藻等光合藻类能合成生育酚。
在目前检测56属285个微藻品种中,裸藻中生育酚含量最高,达1.12~7.35mg/L以干重计,仅一生育酚可达生育酚总量97%以上[8],且裸藻无细胞壁,因此生育酚提取相对容易;
FujitaT[9]等用光能异养方法培养裸藻,6d内细胞浓度可达19.7g/L,生育酚含量可达1.19mg/L。
2.2.微生物生产多价不饱和脂肪酸
20碳5烯酸(EPA)和2碳6烯酸(DHA)均是多价不饱和脂肪酸,多存在于海鱼中,特别是海洋冷水鱼中含量更丰富,此类多烯脂肪酸是人类很有价值医药。
保健产品,有“智能食品”之称。
目前,国内外对其开发十分活跃,不仅源于海鱼,而且通过某些微生物进行生产。
利用海洋微藻生产多不饱和脂防酸研究始于80年代初期,并且多以自养微藻生产DHA和EPA为主,其中三角褐紫藻(P.tricornutum)、紫球藻(Porphyridiumcruentum)、盐生微小绿藻(Nannochloropisissalina)、球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、硅藻(Diatom)等当时被认为最有町能
实现微藻产业化美国、日本、以色列等曾率先采用户外开放大池培养这些自养微藻用以生产PUFA.其结果并不尽人意。
开放大池培养微藻其扳低产量和难以对一些高纯度、高价值产品进行纯种培养缺陷,使其住推广微藻大规模培养上受到诸多目素限制。
首先.能适应于大池培养微藻种必须是在极端环境下能快速生长藻种.然而能满足这些条件藻种目前并不是太多,其次,培养过程受光照、温度等自然环境影响较大.并且易被真菌、原生动物和其他杂藻污染.同时水分蒸发严重,二氧化碳供给不足。
此后,基于上述缺点,科学家们又开辟出新培养方法,主要有密闭式光生物反应器培养和异养培养。
利用密闭式光生物反应器培养微藻。
能够最大限度控制养殖环境.减少污染发生,提高产量,据Cohen和Arad[10]报道,利用这一技术可使Porphyridium产量增加60%~300%,同时还可以降低收获成本。
另外,Johns等[11]则先后从众多积累PUFA微藻中也筛选出能异养藻种.如:
群孢小球藻(Chlorellasorckinana),小球藻(C.saccharophia),柯氏隐甲藻(Crypteodiniumcohnil),菱形藻(Nitzschiaalba).卡德藻(Tetraselmissuecian).单衣藻(Chlamydomonasreinhardtn)。
因此,选育富集DHA和EPA异养藻种,设计适合培养基及选择恰当培养条件,实现微藻大规模异养培养生产PUFA是完全可能.而且也是可行。
2.3.微生物生产抗生素
自1929年英国人发现青霉菌分泌青霉素能抑制葡萄球菌生长以后,相继发现了链霉素、氯霉素、金霉素、土霉素、四环素、新霉素和红霉素等抗菌素。
在近几十年内,抗生素研究又有了飞速发展,已找到抗生素有数千种,其中具有临床效果并已利用发酵法大量生产和广泛应用多达百余种。
同时抗生素产量也大幅度提高,青霉素也由最初100U/mL,通过诱变育种和优化发酵工艺方法,目前以提高到105~106U/mL。
随着抗生素广泛使用,病原菌耐药性也随之提高。
人类迫切需要新一代抗菌药物来代替抗生素。
抗菌肽是生物体内产生一类具有生物活性小分子多肽,最先从昆虫中发现,后来人们相继从细菌、真菌、两栖类动物、哺乳动物乃至人类中也发现并分离获得抗菌肽。
研究表明,抗菌肽对细菌、真菌、病毒和原虫都具有杀灭作用,甚至对癌细胞也有杀伤作用。
在医药方面,抗菌肽可望成为新一代抗菌、抗病毒、抗癌药物。
从昆虫等生物体内分离纯化获得抗菌肽,数量很少,生产成本高,不能满足应用需要。
随着基因工程技术迅速发展,对原有抗菌肽基因进行改造,再将其导入大肠杆菌或酵母菌等工程菌内,获得能产生重组抗菌肽工程菌,为工业化生产抗菌肽提供了全新途径。
梁洁等[12]针对转基因酵母菌生产及产素特点,优化抗菌肽发酵生产工艺,获得摇瓶发酵液杀菌效价为5736IU/mL,在500L发酵罐中培养,发酵液抗菌肽最高效价可达到6734IU/mL。
2.4.微生物生产抗癌药物
在微生物代谢产物中,存在着许多有抗癌活性物质。
在美国,报道从紫杉树皮中获得一种叫安德氏紫杉霉(Taxomycesandreanae)真菌,有产紫杉醇能力;
紫杉醇主要是由红豆衫属树种产生一种二萜类抗癌新药。
经临床验证,具有良好抗肿瘤作用,特别是对癌症发病率较高卵巢癌、子宫癌和乳腺癌等有特效。
紫杉醇是近年国际市场上最热门抗癌药物,被认为是人类未来20年间最有效抗癌药物之一。
,由于紫杉醇在植物体中含量相当低,大约13.6kg树皮才能提出1g紫杉醇,治疗一个卵巢癌患者需要3-12棵百年以上红豆杉树,也因此造成了对红豆杉大量砍伐,致使这种珍贵树种已濒临灭绝。
而通过基因工程技术,微生物发酵等方法可以极大提高产量,降低成本,同时也保护了这些珍惜植物品种。
2001年,周东坡等[13]东北红豆杉中分离到3株紫杉醇产生菌,其中HQD33通过紫外线、EMS、60Co-γ-ray、NTG等诱变剂顺序诱变得到高产突变株NCEU-1,其紫杉醇产量到达314.07μg/L,远远高于原始出发菌株紫杉醇产量(51.06μg/L-125.70μg/L),王世伟等[14]采用双亲灭活原生质体融合实验进一步提高了紫杉醇产量,使紫杉醇产量达到468.62μg/L;
2.5.微生物生产医用酶制剂
目前,我国每年约有60万人死于冠心病,约120万人死于脑梗塞、脑溢血,而美国每年约有15万人死于中风,约80%病例是由于阻止血液流向大脑血凝块引起而导致突发性死亡。
近年来,除链激酶、链道酶、尿激酶、葡萄糖激酶、金葡激酶、组织型纤溶酶激活剂等之外,蚓激酶也得到开发[14]。
它们都是溶血栓有效药物,已进入临床实用。
微生物生产溶栓酶存在其优越性:
只要有高产菌种,生产工艺条件确定以及产品有效性或高效性,即可实现规模生产。
蚓激酶(1umbrokinase,LK),也称蚯蚓纤维蛋白水解酶(earthormfibrinolyticenzymes,EFE)。
是蚯蚓中一种纤溶性蛋白酶。
大量体内外试验表明,多数LK具有抗凝、纤溶、抗血栓及溶血栓作用。
陆琳等[15]采用健康志愿者进行I期临床试验方法,研究注射用蚓激酶对人体出凝血指标变化情况。
结果该注射用蚓激酶具有降纤和抑制血小板聚集作用,且可同时作用于内源性凝血系统,使部分凝血活酶活化时间延长,短时间内就能起到溶栓作用。
而直接从蚯蚓中提取蚓激酶工艺复杂,成本高昂,不适合规模化生产,利用微生物发酵生产蚓激酶是目前热点研究课题。
姜琼等[16]通过载体构建,将蚓激酶基因转化到大肠杆菌中,并实现蚓激酶基因在大肠杆菌中高效表达。
张成瑶[17]将蚓激酶基因转化到毕赤酵母中,实现蚓激酶基因在毕赤酵母中高效表达。
纳豆在日本已有1000多年食用历史,它除了被当作食品食用,民间还可作为药品,以预防和治疗心脑血管性疾病。
1987年,Sumi等[18]报道纳豆提取物含有一种溶解血栓酶,并定名为纳豆激酶(Nat-tokinase)。
该酶能显著溶解体内外血栓,明显缩短优球蛋白溶解时间,并能激活静脉内皮细胞产生纤维蛋白溶酶原激活剂。
作为一种新型溶血栓药物,纳豆激酶和当前使用溶血栓药物相比,具有众多优点,主要表现在[19]:
1.纳豆激酶来源于食品纳豆,安全性可靠;
2.纳豆激酶分子量远远小于UK、t-PA,是一个单链蛋白,易被人体吸收,且作用时间长(大于8h),因此有可能成为口服性药物;
3.纳豆激酶直接作用于纤维蛋白,对纤维蛋白有特异性,但不会破坏体内纤维蛋白原;
4.纳豆激酶可促使血浆中t-PA含量明显增加,从而进一步增加人体纤溶活性;
5.纳豆激酶可以通过液体发酵生产,造价低廉。
由此可见,纳豆激酶在治疗血栓病方面前景十分广阔。
目前,纳豆激酶已经可以通过微生物发酵获得,鲍时翔等[20]通过纳豆菌液体发酵,生产纳豆激酶。
发酵72h后,通过纤维平板法检测得,产酶量相当于786尿激酶IU/mL。
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