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1.2.3调节激素分泌3

1.2.4预防肥胖3

1.2.5缓解酒醉症状3

1.2.6调节心率失常3

1.2.7治疗癫痫3

1.3GABA的生产4

1.3.1化学合成法4

1.3.2植物组织代谢4

1.3.3微生物发酵法4

1.4碳氮源在真菌生长发育中的作用5

1.4.1碳源对真菌生长发育中的影响5

1.4.2氮源对真菌生长发育中的影响5

1.5本项研究的目的、意义和内容6

1.5.1研究目的、意义6

1.5.2研究内容6

1.6本项目技术路线7

2材料与方法9

2.1实验材料9

2.1.2培养基9

2.1.3主要试剂9

2.1.4主要实验仪器10

2.2实验方法10

2.2.1红曲霉菌种复壮10

2.2.2菌种的活化10

2.2.3培养方法10

2.2.5碳源对GABA合成的影响11

2.2.6氮源对GABA合成的影响12

2.2.7培养基碳氮源正交实验12

2.2.8数据整理与分析12

3结果与分析13

3.1标准曲线绘制13

3.2氮源对GABA合成的影响13

3.4碳源对GABA合成的影响14

3.5正交实验结果15

3.6小结19

参考文献20

致谢22

附录23

碳氮源影响红曲霉代谢合成GABA的研究

摘要

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）作为哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质越来越受到关注。

红曲霉作为中国历史悠久的药食两用真菌，其重要的次生代谢产物之一就是GABA。

目前红曲霉的发酵工艺的研究很活跃，通过培养条件的优化提高GABA的产量是众研究者们追求的目标。

本论文根据GABA代谢途径选择不同的碳氮源因子，分别进行单因素轮换实验考察对生物合成GABA有影响的碳氮源因子，并对实验结果有显著影响的碳氮源因子设计五因素四水平的正交实验对其进行优化，最后实验确定较优的碳氮源组合为：

谷氨酸钠1%；

谷氨酸1.25%；

甘氨酸1.5%；

葡萄糖2%；

麦芽糖2.5%，在最优条件下做验证试验后，GABA的产量可达到5.778mg/g。

为促进GABA的高效合成提供一定的参考价值。

关键词：

红曲霉GABA碳氮源优化

TheInfluencesofNitrogenandCarbonSourcesontheGABAsynthesizedbyMonascus

Abstract

γ-aminobutyricacid（γ-aminobutyricacid,GABA）isanimportantinhibitoryneurotransmitterinthemammaliancentralnervoussystem,soresearchesaboutitisincreasingly.MonascusisahistoricmedicinalandediblefungiinChina,oneofitsimportantsecondarymetabolitesisGABA.InrecentyearsresearchaboutMonascusfermentationprocessisveryactive,raisetheproductionofGABAbyoptimizingconditionsoffermentationprocessareallresearcherswantedtobe.

Inthispaper,AccordingtothedifferentmetabolicpathwaysofGABA,Weselectedthefactorofcarbonandnitrogensources,Accordingtothesinglefactorexperiment,FindoutthemosteffectingcarbonandnitrogensourceswhichcanpromotetheSyntheticmetabolicofGABA.Andselectedcarbonandnitrogenfactorswhichhavesignificantimpactontheresult.designthefivefactorsandfourlevelsorthogonalexperimenttooptimizethefermentationprocess.finallyfoundtheoptimumcombinationofcarbonandnitrogensourcesare:

sodiumglutamate1%;

glutamate1.25%;

glycine1.5%;

2%glucose;

maltose2.5%,inoptimalconditionsafterverificationtests,GABAproductioncouldreach5.778mg/g.ProvidecertainreferencevaluetopromoteefficientsynthesisofGABA.

Keywords:

MonascusGABACarbonandnitrogensourcesOptimization

1前言

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质。

具有降低血压、抗焦虑和抑郁、改善睡眠、提高记忆力等生理作用。

2009年，GABA称为中国卫生部批准的新资源食品，天然GABA已被利用到乳制品、软饮料、和酒饮料中[27]。

GABA的合成方式主要有化学合成法、植物富集法和微生物发酵法。

但是化学合成的反应过于激烈和有安全隐患，天然植物中提取GABA受到资源和环境的限制，而微生物发酵提取GABA具有成本低、无化学残留、产量高等优点，是生产GABA的理想途径。

微生物发酵方式分为液态发酵和固态发酵，早期投入GABA生产的主要是大肠杆菌，使用乳酸菌、曲霉菌、酵母菌等微生物也能够发酵制备。

红曲霉作为中国历史悠久的药食两用真菌，其重要的次生代谢产物之一就是GABA[10]。

微生物的生长和代谢产物的累积一方面受到菌种差异本身的影响，另一方面受到营养和环境条件的限制，其生物合成路径、代谢产物种类及其产量与培养基组成成分、发酵条件等环境因素有紧密的联系。

为了提高产量，有必要了解生产菌生长代谢所需的最佳条件。

碳源和氮源为微生物提供最基本的营养成分，对微生物的生长和代谢有着重要的作用。

本论文根据GABA代谢途径选择不同的碳源、氮源因子，各进行单因素轮换实验考察对生物合成GABA有影响的碳氮源因子，并对实验结果有显著影响的碳氮源因子设计正交实验对其进行优化，确定较优的碳氮源组合，为促进GABA的高效合成提供一定的参考价值。

1.1GABA概述

1.1.1GABA的结构及理化性质

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，GABA）是一种非蛋白质构成的天然氨基酸，以自由态的形式普遍存在于原核生物和真核生物中，由谷氨酸（Glutamic-acid，Glu）经谷氨酸脱羧酶（Glutamatedecarboxylase，GAD）催化转化而来。

纯的GABA在常温下为白色结晶体或结晶状粉末，微臭，无旋光性，吸湿性强，易溶于水，微溶于热乙醇，不溶于冷乙醇、乙醚和苯，为极性物质。

从乙醇中结晶可以得到棱柱体。

结晶产物不易吸收水分，尽管在高温环境下也不会结块，但在真空环境下易升华。

熔点202～204℃，熔化后分解成吡咯烷酮和水。

1.1.2GABA的生物合成机理

在细菌和哺乳动物大脑中，GABA先在GABA转氨酶（7-Aminobutyratetransaminase）的催化下，和α-酮戊二酸产生转氨作用构成琥珀酸半醛（SSA）和Glu，然后SSA在琥珀酸半醛脱氢酶（succinatesemialehyde-dehydrogenase，简称SSADH）氧化形成琥珀酸进入三羧酸循环，这些反应和GAD催化的Glu脱羧反应一起，形成了α-酮戊二酸氧化成琥珀酸的另外一条支路，称之为GABA支路。

图1.1GABA代谢合成图

经学者多年的研究发现，植物有两种方法来合成GABA：

一是由谷氨酸脱羧酶催化的GABA支路；

另外是由多胺降解的，多胺降解也可转化为GABA。

腐胺经二胺氧化酶催化，可形成吡咯啉、过氧化氢和氨；

在多胺氧化酶的作用下，亚精胺和精氨分别氧化成吡咯啉、1-（3-丙氨基）2-吡咯啉以及二氨基丙烷和过氧化氢，吡咯啉又可在吡咯啉脱氢酶的催化下构成GABA。

1.2GABA的生理功能

在哺乳动物体内，GABA是中枢神经系统中的一种重要的抑制性神经递质，它通过存在于神经突触后膜的三种受体，即GABAA，GABAB和GABAC及与其它神经递质的交互作用，参与了各类动物体内重要的行动和生理反应的调节。

因此，将GABA应用于功能性食品、医药品是很有发展前景的。

1.2.1预防高血压

GABA能促进脑部血液循环、促进氧供应，脑细胞功能亢进。

高血压是现代中国的老年人常见的疾病，估计我国高血压患者超出1亿。

现在，临床上常常使用GABA来改善脑血栓后遗症、脑动脉硬化症等造成的头疼以及耳鸣、抑郁症等疾病。

使用GABA还可以使血管扩张，降低血压[28]。

高血压患者常因肾功能不强，不能使多余的盐分从尿中排出，GABA可以活化肾功能，然后激活利尿作用将多余的盐分从尿中排出，使血压降低，预防高血压。

1.2.2抗衰老

红曲萃取物中含有高活性的SOD类似物，具有极优良的抗氧化力。

研究发现缺乏GABA可能是脑老化的原因，中国科学技术大学等研究人员对老年恒河短尾猴进行研究后发现：

GABA能促使大脑处于活跃状态。

随着动物年龄的增长，大脑中GABA含量会越来越少，短尾猴的视觉功能会随年龄的增大而衰退，将GABA注入老龄短尾猴体内后，它们的视力有明显好转，此研究证明GABA能帮助神经细胞处于对信号的高识别能力状态[27]。

1.2.3调节激素分泌

GABA作为抑制性神经递质，可参与调节垂体和性腺的分泌，GABA通过多巴胺抑制系统抑制垂体激素-促黄体激素和催乳素的分泌起作用。

GABA和孕激素的协同作用，能显著提高精子的活动能力[26]。

1.2.4预防肥胖

张辉等[29]对长时间食用富含GABA米胚芽的大鼠进行研究，发现大鼠体重增加明显受到抑制，证明富含GABA米胚芽拥有预防肥胖的功效。

1.2.5缓解酒醉症状

由于GABA能促进酒精代谢，因此可以用来醒酒，顾振新等[27]研究发现饮酒者在食用富含GABA米胚芽后，血液中的乙醇以及乙醛浓度显著低于对照组。

1.2.6调节心率失常

GABA能抑制心律失常的发生，参与心血管功能的调节，梦娟好等研究发现GABA主要是通过对心脏的直接作用而对抗乌头碱性心律失常[27]。

1.2.7治疗癫痫

癫痫的产生和中枢神经递质之间有密切关系。

癫痛是中枢神经系统的一种常见病，发病率为0.5%～1.5%，是一种引起脑功能障碍的临床综合症。

癫痫病人脑脊髓中GABA较常人显著低下，且其程度与发病类型相关[17]。

1.2.8其它功能

GABA还具有其他诸多生理功能，如多刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌。

1.3GABA的生产

GABA的制备方法包括化学合成法和生物合成法。

此外，又根据酶的来源不同，可将生物合成法分成植物组织代谢和微生物发酵两种。

1.3.1化学合成法

化学合成法主要是通过γ-氯丁氰的取代水合反应合成。

邻苯二甲酰亚氨钾与γ-氯丁氰于180℃发生反应，然后用浓硫酸回流产品，结晶。

因为化学合成法合成的

GABA常常有其它副产物或化学物残留物，在食品中应用有很大的局限性，主要应用于化工和医药领域中。

[27]

1.3.2植物组织代谢

植物组织代谢主要是使用内源酶转化制备GABA。

蔬菜、水果、谷物、海藻以及蘑菇等植物体都含有丰富的GABA，例如菠菜中含量高达414nmol/g；

栗子中的GABA含量达188nmol/g；

谷物中的GABA含量在55～718nmol/g，大米胚芽和大豆芽中含量较高[19]，尽管很多天然食品中GABA的含量较为丰富，但是单单依靠从天然食物中获取GABA远远不能满足人体的需求。

为了解决这一问题，众多科学家投身GABA的富集研究，目前，已取得了很多成果[8]。

发达国家对于食品来源的GABA富集和生产研究已经取得许多成果，在2007年日本可口可乐公司就推出了面向大众的，拥有放松和抗紧张功效的GABA饮料[26]。

利用红曲霉发酵生产具有很大商业化的开发前景。

而我国对于GABA富集和生产技术的研究起步较晚，起点较低。

随着GABA的生理功能逐步被人们了解及高血压等众多疾病的增多，很有必要加大GABA研究和开发力度。

1.3.3微生物发酵法

微生物发酵法最先使用的是大肠杆菌，之后使用乳酸菌、曲霉菌等微生物发酵生产GABA。

红曲霉研究历史悠久，安全性可靠且代谢产物种类多样，利用红曲霉发酵生产GABA具有独特的优势[12]。

GABA作为红曲霉的又一重要代谢产物，2009年我国已将其批准为新资源食品，它具有良好的生理活性。

Kono等[25]对红曲霉产GABA进行了研究，γ-氨基丁酸的产率达到了120ug/g。

Wang等[23]用MonascuspurpureusNTU601进行固体发酵，GABA含量达到了5004mg/kg，Su[24]等也报道了采用Monascuspurpureus进行固体发酵，GABA含量达到了1200mg/kg。

后家衡等[3]红曲霉液态发酵工艺进行整体优化，得到的较好优化条件为：

培养温度35℃、初始pH5.0、摇床速度120r/min，优化发酵条件下GABA的产量提高到7.8269/L。

雷恒[7]等对红曲霉固态发酵工艺进行了优化，得到产GABA较佳的培养基：

葡萄糖5%，大豆蛋白粉4%，KH2PO40.15%，ZnSO40.3%，NaNO30.5%，MgSO40.1%，在最优条件下GABA产量达到5.08mg/g。

刘辉[6]等对红曲霉液态发酵工艺进行优化后GABA产量可达595.1mg/L，得到最优发酵条件为：

大米粉6.4%，蛋白陈为0.5%，K2HPO40.23%，MgSO40.l%，初始pH0..4，摇床转速160r/min，培养温度35℃。

叶砚等[8]通过对培养基组分的优化，最终GABA产量达到6.26g/L。

1.4碳氮源在真菌生长发育中的作用

1.4.1碳源对真菌生长发育中的影响

碳源是微生物生长必需的成分，大概可以占细胞干重的50%，它是菌体生命活动必需的物质。

真菌作为一个群体，能利用多种碳源，这些碳源的范围从小分子的糖、有机酸、乙醇到大分子的多聚物，如蛋白质、脂类、多糖和木质素等。

糖类是提供真菌碳源的一种重要形式。

真菌利用单糖及其衍生物的能力因种类不同而有差异。

几乎所有的真菌都喜欢利用葡萄糖，果糖是五碳糖，是仅次于葡萄糖的优秀碳源。

很多真菌能利用单糖却不能利用由同种单糖成分组成的双糖或者较大分子的糖，可能是这些真菌缺乏分解双糖的能力。

最普遍的双糖中，麦芽糖和纤维二糖能被真菌普遍利用，只有少量真菌能利用蔗糖，更少量的真菌能利用乳糖。

很多真菌能使用寡糖和多聚糖作为碳源，但总的来说，这些大分子糖类被利用之前先利用所分泌的各种酶将其水解为亚单位。

淀粉是一种植物多聚糖，能被大多数真菌利用，淀粉酶是一种可诱导的酶，在有淀粉存在时它才被合成。

1.4.2氮源对真菌生长发育中的影响

氮源对于真菌的生长发育是必不可少的，是真菌合成核酸、蛋白质和酶类的主要原料，它的作用主要是合成各种关键的细胞组分，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、氨基葡糖、几丁质以及种种维生素等。

真菌能利用的无机氮源主要包括一些铵盐、硝酸盐以及亚硝酸盐等。

大多数真菌能够利用硝酸盐（一些不含硝酸盐还原酶的菌种则无法利用），而亚硝酸盐虽可作为氮源被少许真菌利用，但它对于多半真菌是有毒的。

绝大多数真菌可以使用铵盐作为主要的氮源，相对于硝酸盐真菌往往优先利用铵。

此外，铵还可以影响真菌中一系列发育系统的调节。

大多数真菌可以使用有机氮作为氮源，但这些有机氮并不是都能很好地被利用。

真菌能够分解自然界中的蛋白质变成可被吸收的氨基酸。

甘氨酸、谷氨酸以及天冬氨酸是真菌喜欢的氮源，真菌对于不同的氨基酸有着不同的要求，对于任何一种氨基酸，不同的真菌有着不同的反应与需求，而混合的氨基酸比单一氨基酸对真菌生长更为有利。

1.5本项研究的目的、意义和内容

1.5.1研究目的、意义

GABA是一种抑制性神经递质，具有调节心血管活动、调节心律失常、营养神经细胞等生理功能。

红曲中的GABA在日本首次被发现。

日本国立健康研究所在往饲料中添加红曲培养物后，发现这能使患有高血压症老鼠的血压从超过200mmHg降至180mmHg以下，并证实了其有效成分为GABA[29]。

现在，许多研究者在对Y-氨基丁酸进行深入研究，希望可以研制出治疗高血压的药物，而红曲霉因其具有生产GABA的特性，更是成为了研究的热点[27]。

微生物的生长和代谢产物的积累一方面受到菌种差异本身的影响，另一方面受到营养和环境条件的制约，其生物合成途径、代谢产物种类及其产量与培养基成分、发酵条件等环境因素有密切的联系。

要使生物合成GABA能进行扩大规模投入到实际的工业生产应用中，制约的一大因素就是对发酵条件优化，尽可能的利用菌株GABA高产能力，以最经济、节能、环保的方式进行生产。

碳源和氮源为微生物提供最基本的营养成分，对微生物的生长和代谢有着重要的作用，所以对影响红曲霉产GABA的碳氮源进行考察，并对其进行优化是很有必要的。

1.5.2研究内容

1.根据GABA代谢途径选择不同的碳源因子，包括单糖、双糖、多糖；

单因素试验考察对生物合成有影响的碳源因子；

2.根据GABA代谢途径选择不同的氮源因子，包括有机氮和无机氮；

单因素试验考察对生物合成有影响的氮源因子；

3.根据不同碳氮源的单因子实验筛选出影响最明显的碳氮源因子，用筛选出的碳氮源进行正交实验。

1.6本项目技术路线

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1红曲霉菌株3.4577-101，保存于贵州大学生命科学学院真菌研究所。

2.1.2培养基

察氏培养基[5]：

蔗糖30g，硝酸钠3g，七水合硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，七水合硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾1g，蒸馏水1000mL，PH自然。

用于液体发酵培养。

PDA培养基：

马铃薯200g切块，水煮沸30min，过滤取汁，加入葡萄糖20g，琼脂粉20g，水1000mL，PH自然。

用于斜面培养。

种子培养基：

葡萄糖50g，蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸二氢钾1g，七水合硫酸亚铁0.01g，七水合硫酸镁0.5g，蒸馏水1000mL，PH6.0。

2.1.3主要试剂

硝酸铵、硝酸钠、半胱氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、甲硫氨酸（蛋氨酸）、谷氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、精氨酸、高丝氨酸、谷氨酸钠，北京索来宝科技有限公司

葡萄糖成都金山化学试剂有限公司

麦芽糖成都金山化学试剂有限公司

木糖

蔗糖汕头市西陇化工厂

果糖

淀粉

七水合硫酸镁天津市大茂化学试剂厂

七水合硫酸亚铁天津科密欧化学试剂有限公司

氯化钾重庆川江化学试剂厂

氯化钠

磷酸氢二钾天津市大茂化学试剂厂

磷酸二氢钾北京精求化工厂

硝酸钠上海化学试剂总厂

硝酸铵成都科龙化工试剂厂

蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任公司

酵母膏北京奥博星生物技术有限责任公司

琼脂粉上海博微生物科技有限公司

无水乙醇成都金山化学试剂有限公司

苯酚天津市大茂化学试剂厂

次氯酸钠天津市福晨化学试剂厂

硼酸武汉龙睿达科技发展有限公司

2.1.4主要实验仪器

JA2003电子天平上海天平制造厂

SW-CJ-1F垂直流洁净工作台江苏金净净化设备科技有限公司

DH-36DA电热恒温培养箱北京科伟永兴仪器有限公司

移液枪Eppendorf

LCZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂

UV9100紫外分光光度计北京普析通用仪器有限公司

202-OA型电热恒温干燥箱沪南电炉烘箱厂

THZ-82A数显气浴恒温振荡器常州普天仪器制造有限公司

TW8恒温水浴锅优莱博技术（北京）有限公司

高速离心机MicroCL17美国ThermoScientific

低速离心机TD6M江苏金坛市亿通科学仪器厂

2.2实验方法

2.2.1红曲霉菌种复壮

将红曲霉菌种接种于装有PDA培养基的试管中，30℃培养7天，用0.9%的NaCl溶液洗下孢子，转入带有玻璃珠的无菌三角瓶中，震荡充分打散孢子，四层擦镜纸过滤，制成终浓度为106个/mL的均一孢子悬液。

涂布于PDA培养基平板，选取典型3.4577-101形态的单菌落，转到PDA培养基斜面。

2.2.2菌种的活化

复壮完成后挑取尖端菌丝体转接在斜面培养基，就是活化的菌种。

2.2.3培养方法

1.孢子悬液制备：

红曲霉菌株斜面28℃培养7天，用无菌吐温生理盐水洗下孢子，转入带有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡，充分打散孢子，用4层无菌镜头纸过滤除去菌丝，制成终浓度为106个/mL的均一孢子悬液，备用。

2.种子液的制备：

在无菌条件下，按照10%（v/v）将孢子悬液接种于装有50mL种子培养基的250mL的三角瓶中，28℃，150r/min恒温摇床中培养48h。

3.红曲霉的液体发酵培养

在无菌条件下，按照10%（v/v）将种子液接种于装有30mL察氏改良培养基250mL三角瓶中，28℃，150r/min培养7天。

2.2.4GABA的含量测定方法-Berthelot法[30]

1）标准溶液的制备方法

准确称取2500.000mgGABA标准样品用超纯水溶解，定容至500mL，配5.0mg/mL的标准溶液。

使用时准确配制0，0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，2.50，5.00mg/mL的GABA标准溶液系列。

2）GABA最大吸收波长的确定方法

取8支干燥洁净的试管准确吸取0，0.05，0.10，0.25，0.50，1.00，2.50，5.00mg/mL的GABA标准溶液1.0mL，在冰浴状态下加0.5mL硼酸缓冲液（0.2mol/L、