生物技术制药重点剖析Word格式文档下载.docx

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•配基固定化

•亲和吸附

•洗涤

•洗脱解离

•再生

3.凝胶过滤

4.反相层析和疏水层析

•反相层析：

有机溶液洗脱，蛋白质可能变性

•疏水层析：

盐溶液洗脱

3.动物细胞培养常用溶液、培养基、生产用动物细胞

动物细胞培养基是维持动物组织及细胞在体外生存、生长的基本的营养物质。

1．天然培养基：

直接采用取自动物体液或组织中提取的成分作培养液，如乳蛋白水解物、酪蛋白水解物、血清、血浆及胚胎浸出液等（维持液：

含低浓度或不含小牛血清/生长液：

含5％～20％小牛血清）

2．合成培养基：

化学成分主要为氨基酸、碳水化合物、蛋白质、核酸类物质、维生素、辅酶、激素、生长因子、微量元素及缓冲剂等。

（Eagle培养基含有13种氨基酸、9种维生素、6种无机盐及葡萄糖；

199培养基含21种氨基酸、17种维生素、7种无机盐、4种嘌呤、2种嘧啶、谷胱甘肽、ATP、胆固醇、吐温-80、脱氧核糖、核糖、葡萄糖及醋酸钠。

）

3．血清培养基：

不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基

无血清培养基:

在培养基中增加某些适于细胞生长的成分，如纤连蛋白、转铁蛋白、胰岛素、表皮生长因子等

3．无血清培养基（serum—freemedium）

第一代不含有血清，但含有大量的动物或植物蛋白

第二代完全不用动物来源的蛋白质，蛋白质含量很低

（少于100g/ml），使重组蛋白的纯化简单

第三代完全不含有蛋白质或含量极低，没有任何动物、

人类蛋白或多肽

新一代无血清、无蛋白质、无动物来源、成分确定

动物细胞培养常用的其他溶液

1．平衡盐溶液

2．培养基pH调整液

3．细胞消化液

4．抗生素溶液

生理盐水葡萄糖

维持细胞渗透压、调控培养液酸碱度平衡

酚红指示剂pH黄/紫红

Hanks液缓冲能力弱

Earle液缓冲能力强

合成培养液微酸性，需调整pH

单独配制，单独灭菌，待灭菌后的培养基使用前再加入

3.7％、5.6％、7.4％NaHCO3溶液、羟乙基哌嗪乙磺酸液

（1）胰蛋白酶溶液：

分离自牛、猪等动物胰脏的胰蛋白酶（trypsin）呈黄白色粉末状，极易潮解，注意冷藏干燥保存.常用1:

125和1:

250两种浓度

（2）EDTA溶液：

一种化学螯合剂，其溶液又称Versen液，对细胞具一定的非酶性解离作用。

常用浓度0.02％（个别细胞系要求浓度较高）使用完，需用Hanks液冲洗净（血清对其无终止作用）

防止发生微生物污染青霉素、链霉素、卡那霉素、制霉菌素

生产用动物细胞的种类

1．原代细胞：

直接将动物组织或器官经过粉碎、消化而制得的悬浮细胞

（需要大量的动物组织原料、不能直接从细胞库获得、生长分裂不旺盛）

2．传代细胞系：

原代细胞经过传代、筛选、克隆等步骤，从多种细胞中纯化得到的某种具有一定特征的细胞系

（在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处/有时是从肿瘤细胞衍生而来/从动物胚胎组织中获取，有明显的贴壁和接触抑制特性，有正常细胞的核型，一般可传代培养50代，且无致瘤性/广泛用于人用治疗性药物的生产，不够理想）

3．转化细胞系：

正常细胞经过某个转化过程，失去正常细胞的特点而获得无限增殖的能力得到的细胞系（大规模工业化生产）

（无限的生命力/较短的倍增时间/较低的培养条件要求

Vero（正常成年非洲绿猴肾细胞）、CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）、Namalwa细胞（淋巴瘤细胞）和BHK-21细胞（幼鼠肾细胞））

4．工程细胞系：

采用细胞融合技术或基因工程技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系

（1）融合细胞系：

通过动物细胞融合技术构建

（2）基因工程细胞系：

通过表达载体的构建、表达载体的导入以及表达细胞株的筛选而构建

4.抗体的结构、抗体的种类、嵌合抗体、人源化抗体

基本结构：

抗体单体由4条多肽链（2条相同的重链和2条相同的轻链）通过二硫键（-S-S-）链接而成，为“Y”字形结构。

1.轻链（L链）

2.重链（H链）

3.可变区（V区）:

识别并特异性结合抗原：

与毒素结合可以中和其毒性/与病原体结合，可以组织其对机体细胞的黏附和感染

恒定区（C区）:

1.激活补体系统

抗体（IgM、IgG）与抗原结合形成复合物可通过启动C1q激活补体经典途径；

IgG4、IgA和IgE的聚合物可以激活补体旁路途径。

2.介导免疫细胞活性

抗体的调理作用；

ADCC作用；

介导超敏反应

3.穿过胎盘与黏膜

IgG是唯一能够从母体通过胎盘屏障转运到胎儿体内的抗体（胎儿抗感染）

分泌型IgA合成和主要作用部位在黏膜（黏膜局部抗感染）

4.超变区（HVR），又可称为互补决定区（CDR）

骨架区（FR）

5.铰链区

6.抗原特异性结合部位

7.补体结合位点

8.巨噬细胞等的结合位

抗体的种类：

Fab和Fv、单链抗体、双链抗体、抗体融合蛋白、嵌合抗体、人源化抗体、超变区多肽、特殊抗

嵌合抗体:

是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达的抗体，表达的抗体轻重链V区是异源，而C区是人源的，即整个抗体分子60%-70%是人源的。

人源化抗体：

把鼠抗体的CDR序列一直到人抗体的可变区内，所得的抗体。

5.疫苗的种类、各种亚单位疫苗

1.灭活疫苗

2.减毒活疫苗

3.亚单位疫苗

4.联合疫苗

5.核酸疫苗

6.治疗性疫苗

灭活疫苗又称死疫苗，是指利用加热或甲醛等理化方法将人工大量培养的完整的病原微生物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持其免疫原性，并结合相应的佐剂而制成的疫苗。

疫苗液中除含有灭活的病毒颗粒外，还含有细胞成分和培养病毒时加入的牛血清等蛋白类物质，多次接种疫苗容易发生过敏反应。

灭活疫苗的优点

制造工艺简单

免疫原性的稳定性高

易于制备多价疫苗

灭活疫苗的缺点

需要严格的灭活操作，保证疫苗中不含有灭活不完全的颗粒。

需要进行多次接种，由于机体反复接受疫苗中的异性蛋白质的刺激，而可能出现不良的过敏反应。

接种灭活疫苗产生的抗体滴度随时间而下降

灭活疫苗需要量大

减毒活疫苗又称弱毒疫苗，是指将微生物的自然强毒株通过物理、化学和生物学的方法，连续传代，使其对原宿主丧失致病力，或只引起亚临床感染，但仍保持良好的免疫原性、遗传特性，用这种毒株制备的疫苗就叫减毒活疫苗。

减毒活疫苗的作用机制最类似自然感染免疫，因而具有类似自然感染的优越性。

当前使用的病毒疫苗多数是减毒活疫苗。

常用的减毒方法：

→体外减毒:

:

即体外连续传代减毒。

在异源宿主中连续传代；

在单一宿主中反复连续传代。

→冷适应筛选

✓温度可以改变病毒的特性，得到冷适应株。

✓病毒冷适应株常伴有毒力减弱和各种特征性标志。

✓冷适应筛选稳定的减毒突变株是在传统疫苗设计中较早采用的方法，而且也是最为行之有效的思路。

减毒活疫苗的优点

1）可以诱导更全面的免疫应答

2）可诱导较强的免疫反应，理论上只需要接种一次

3）可能引起水平传播，扩大免疫效果

4）生产工艺简单，价格低廉。

减毒活疫苗的缺点

1）有可能出现毒力回复

2）可能造成环境污染而引发交叉感染等，并可能滞留在环境中形成传染源

3）产品的分析评估较为困难

4）保存、运输条件要求较高

亚单位疫苗是指提取或合成细菌、病毒外壳的特殊蛋白结构，即抗原决定簇制成的疫苗，这类疫苗不是完整的病毒，是病毒的一部分物质，故称亚单位疫苗。

亚单位疫苗仅有几种主要表面蛋白，因而能消除病毒（或细菌）的许多无关抗原决定簇和粗制或半提纯的病毒（或细菌）制剂诱发的不良反应。

亚单位疫苗：

Ø

纯化亚单位疫苗

合成肽亚单位疫苗

基因工程亚单位疫苗

合成肽亚单位疫苗（Syntheticpeptidesubunitvaccine）

合成肽疫苗是指使用化学方法合成能够诱发机体产生免疫保护的多肽制成的疫苗。

优点：

①纯度和安全性高；

②副作用小；

③可长期在常温下保存；

缺点：

①其抗原性单一；

②免疫原性弱。

因此须用几种合成肽抗原联合使用，还须用多种方法提高合成肽的免疫原性。

灭活疫苗

减毒活疫苗

亚单位疫苗

制备方法

通过化学或物理方法使病原体失活

通过非正常培养选择减毒株或无毒株

以化学方法获得病原体的某些具有免疫原性的成分

免疫机理

病原体失去毒力但保持免疫原性，接种后产生特异抗体或致敏淋巴细胞

接种后病原体在体内有一定生长繁殖能力，类似隐性感染，产生细胞、体液和局部免疫

接种后能刺激机体产生特异性免疫

疫苗稳定性

相对稳定

相对不稳定

稳定

毒力回升

不可能

有可能

免疫接种

多次免疫接种

一般为一次性

安全性

较安全

对免疫缺陷者有危险

安全性好

常用疫苗

乙脑、脊髓灰质炎灭活疫苗

麻疹、脊髓灰质炎减毒活疫苗

白喉、破伤风类毒素，A群脑膜炎球菌多糖疫苗

基因工程亚单位疫苗：

是指在分离出病原体特异抗原编码基因的基础上，将外源基因转入另一个非致病性的微生物内表达基因产物，然后通过分离和纯化而获得特异性的蛋白质。

基因工程亚单位疫苗的优点：

①产量高；

②纯度高；

③安全性高；

④用于病原体难于培养或有潜在致癌性，或有免疫病理作用的疫苗研究。

基因工程亚单位疫苗的缺点：

与传统亚单位疫苗相比，免疫效果较差。

增强其免疫原性的方法：

①调整基因组合使之表达成颗粒性结构

②在体外加以聚团化，包入脂质体或胶囊微球

③加入有免疫增强作用的化合物作为佐剂（adjuvant）。

6.固定化酶的性质和指标、有机相的酶反应

固定化酶性质的改变：

1.酶活力的改变：

固定话酶活力小于天然酶，专一性也会发生改变

2.酶稳定性的提高：

热稳定性

3.酶最适合PH改变：

负电荷载体制备的固定化酶，最适pH提高；

反之亦然

4.酶最适温度提高

5.米氏常数KM变化

指标：

1.固定化酶（细胞）的活力

酶催化某特定化学反应的能力，可表示为一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度。

单位：

每毫克干重固定化酶（细胞）每分钟转化底物（或生产产物）的量，表示为mol/（min.mg）

2.偶联率及相对活力的测定：

用以表示影响酶固有性质诸因素的综合效应及固定化期间引起的酶失活

固定化酶的活力回收是指固定化以后固定化酶（或细胞）所显示的活力占被固定的等量游离酶（细胞）总活力的百分数

3.固定化酶（细胞）的半衰期

在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示

是衡量操作稳定型的指标，而操作稳定性是影响实用的关键因素。

4.固定化酶的热稳定性

将固定化酶在不同温度下温育1h之后，在最适温度下测定酶活力，固定化酶的活力一般应保持在60%以上。

为什么采用有机相进行酶反应？

对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。

因为许多有机化合物（底物）在水介质中难溶或不溶。

水的存在往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反应的发生。

有机相中酶反应的优点

减少水引起的副反应

有利于疏水性底物的反应

热力学平衡向产物方向移动

提高酶的稳定性

酶不溶于有机介质，利于回收利用

从低沸点的溶剂中易分离纯化产物

无微生物污染

规模生产

水解反应（脂肪酶、蛋白酶）

腈水解反应（腈水解酶、水合酶）

腈合成反应（羟腈化酶）

酯化/酰化反应（脂肪酶、蛋白酶）

羰基还原反应（酮还原酶、醇脱氢酶）

有机相酶反应的溶剂体系

水-水溶性溶剂均相体系

水-水不溶性溶剂两相体系

反相胶团（束）体系

单向有机溶剂体系

影响有机相酶反应的主要因素:

水含量/有机溶剂/酶/固定化载体/pH

7.发酵过程的影响因素及控制、优良菌种的选育

发酵过程的影响因素及控制

有一个好的菌种以后要有一个配合菌种生长的最佳条件，使菌种的潜能发挥出来

目标是得到最高的产品收率。

发挥菌种的最大生产潜力考虑之点

菌种本身的代谢特点生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速率

菌代谢与环境的相关性温度、pH、渗透压、离子强度、溶氧浓度、剪切力等

（一）菌体浓度的影响及控制

•菌体浓度：

是指单位体积培养液中菌体的含量。

菌体浓度不仅反映菌体细胞的多少，而且反映菌体细胞生理特性的不同阶段。

•菌体浓度大小主要取决于：

菌体的生长速率以及营养物质和环境条件（温度、pH、渗透压和水）。

（二）菌体浓度与产物产率的关系

在适当的生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓度成正比关系。

但是，菌体浓度过高，往往也会产生其他的影响，如营养物质消耗过快，培养液的营养成分发生明显的改变，有毒物质的累积，有可能改变菌体的代谢途径，特别是对培养液中的溶解氧影响尤为明显，影响产物产率。

菌体浓度过低，同样使产物的产率下降。

控制:

•在发酵过程中必须设法使菌体浓度控制在合适的范围内。

•通过调节培养基中营养基质的浓度来控制。

首先要有适当的配比，然后通过中间补料来调整。

（二）营养物质对发酵的合成和控制

各种营养物质对微生物生长繁殖和代谢产物的合成都很重要。

1.碳源的影响及控制

2.氮源的影响及控制

3.磷酸盐的影响及控制

4.补料的控制

1.碳源的影响及控制

•碳源可以分为速效碳源和迟效碳源。

•速效碳源能被微生物快速利用，合成菌体和产生能量，因此有利于菌体的生长，但过多的分解代谢产物有时会对目标产物的合成产生分解代谢阻遏作用，不利于产物的合成。

•迟效碳源为菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于延长抗生素的分泌期。

•工业上，采用速效和迟效碳源的混合培养基来控制菌体的生长和产物的合成。

•举例：

青霉素——乳糖或缓慢滴加葡萄糖

2.氮源的影响与控制

•氮源分为速效氮源和迟效氮源。

•氨基（或铵）态氮（氨基酸、硫酸铵）和玉米浆属速效氮源，能被菌体快速利用，促进菌体生长，但对某些代谢产物的合成，如抗生素的合成产生调节作用，影响产量。

•迟效氮源如黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉等，对延长次级代谢产物的分泌期，提高产量十分重要。

•发酵过程，要选择合适的氮源和含量。

一般选用含速效和迟效的混合氮源。

3.磷酸盐的影响和控制

•磷是微生物分解代谢和合成代谢所必须的成分，保证微生物正常生长所必需的磷酸盐浓度一般为0.32~300mmol，而对次级代谢产物而言所允许的最高平均浓度为1.0mmol，超过10mmol就明显抑制产物合成，因此控制磷酸盐浓度对微生物药物，特别是次级代谢产物的发酵生产是非常重要的。

•补料对发酵起到了重要作用：

丰富了培养基，避免了菌体过早衰老，使产物合成期延长；

控制pH和代谢方向；

改善通气效果；

补足因发酵过程中减少的发酵液体积。

•补料的物质包括碳源、氮源、水和其他物质（磷酸盐、前体等）。

•补料在菌体生长旺盛后期，发酵液泡沫液位下降后开始。

•补料的关键：

控制补料的时间、速率和料配比。

（三）温度的影响及控制

不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：

嗜冷菌适应于0～260C生长，嗜温菌适应于15～430C生长，嗜热菌适应于37～650C生长，嗜高温菌适应于650C以上生长

（四）pH的影响和控制

每一类菌都有其最适的和能耐受的pH范围，大多数细菌生长的最适pH范围在6.3~7.5，霉菌和酵母菌生长的最适pH范围为3~6，放线菌生长的最适pH范围为7~8。

微生物生长阶段和产物合成阶段的最适pH往往不一样，这与菌种的特性和产物的化学性质有关。

引起发酵液pH下降的因素：

培养基中碳、氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或中间补糖过多，加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累而使pH下降；

消沫剂加的过多，生理酸性物质的存在及氮被利用等。

引起发酵液pH上升的因素：

培养基中碳、氮比例不当，氮源过多，氨基酸释放等；

生理碱性物质存在，中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多等。

（五）溶氧的影响和控制

•溶氧是需氧微生物生长所必需的。

•发酵过程中需要不断通气和搅拌，才能满足溶氧要求。

•发酵过程中应保持氧浓度在临界氧浓度以上。

•一般发酵前期，由于产生菌大量繁殖，需氧量大幅度增加，如果此时需氧超过了供养，会使溶解氧明显下降，溶解氧曲线出现一个低峰。

（七）泡沫的影响与控制

•发酵过程起泡的利弊：

气体分散、增加气液接触面积，但过多的泡沫是有害的

•泡沫的定义：

一般来说：

泡沫是气体在液体中的粗分散体，属于气液非均相体系

•美国道康宁公司对泡沫这样定义：

体积密度接近气体，而不接近液体的“气/液”分散体。

优良菌种的选育

1.遗传性转稳定

2.生长速度快,不易污染

3.目标产物产量尽可能接近理论转化率

4.目标产物最好分泌到胞外

5.尽可能减少类似物的产量

6.其所利用生长的培养基简单,价格低廉

8.羟化反应、脱氢反应、甾体边链降解

1.甾体的微生物转化：

羟化反应

微生物对甾体羟化的位点众多，其中以c9α、c11α，c11β、c14α,c15α,c16α,c16β、c17α、c19角甲基和边链c26位上的羟化较为重要。

微生物转化甾体的羟化酶多是细胞色素P450依赖型，P450作为末端氧化酶，需要利用分子氧以及与NADPH-依赖的脱氢酶相连接的电子转移系统。

羟化酶所转化的羟基由空气中的氧直接取代甾体上的氢形成，因此工业上利用黑根霉菌转化甾体时需要充分供氧

1）C9α羟化：

C9位导入羟基后，容易在C9-C10之间引入双键，并可进一步导入C11β-羟基或导入氟原子，因此C9α羟化属于甾体药物合成中的一个关键中间步骤。

另一方面，C9α羟化还涉及甾体边链选择性降解，在微生物降解甾体边链过程中，防止甾体母核破裂的关键是抑制9α-羟化酶对9α的羟化。

2）C11α羟化：

微生物所特有的C11α羟化反应是最早应用于工业生产的微生物转化反应，它的成功应用替代了困难的化学合成，而其在皮质激素类药物的合成中所得产物具有强抗炎活性，促进了皮质激素类药物的合成。

3）C11β羟化：

C11β羟化同样可以应用于甾体激素生产。

其中研究较广泛的有新月弯孢霉，该霉菌对底物结构的变化有较广的耐受性，能对许多结构不同的甾体进行11β-羟化。

4）C15α羟化:

研究人员将雷斯青霉固定在海藻酸钙凝胶上制成固定化细胞进行生产，生产后15α羟化活性可恢复。

应用β-环糊精无论使用游离细胞还是固定化细胞都能提高转化率。

5）C16α羟化：

除C11位点的羟化外，皮质甾体类药物合成中的另一个重要反应是甾体母核的C16α羟化。

目前C16α羟化常采用放线菌进行生物转化，导入C16α-羟基后，使其对电解质影响减小，同时抗炎和糖代谢作用不变。

6）C17α羟化：

在甾体母核上引入C17α-羟基后能增加皮质甾体药物的抗炎和糖代谢作用。

绿色木霉能对黄体酮的C17α羟化，树枝状孢囊菌和小瓶瘤孢菌也能对甾体母核进行C17α羟化。

7）C19α羟化:

C19α羟化产物是制备19-失碳甾体化合物的重要中间体。

19-失碳甾体较原甾体具有更显著的生理活性，如19失碳孕甾酮的疗效较孕甾酮活性高4〜8倍。

8）双羟基化：

目前，甾体母核常见的双羟基化反应一般发生在C7与C15位置。

并头状菌属的某些菌株能将黄体酮转化为7α,15β-双羟基黄体酮。

脱氢反应

在皮质甾体类药物的母核C1,2位置导入双键后，能成倍地增加其抗炎活性。

但由于在动物体内缺乏相应的酶，甾体激素类化合物的C1,2脱氢反应不能进行，而通过体外进行c1,2脱氢，即可得到更高效的甾体药物，这也是人工改造获得高效药物的典型例子。

采用化学脱氢的方法，一般用二氧化硒脱除法，产品中带有少量难以除尽的对人体有毒害的硒。

微生物脱氢高效无毒，目前己经成为甾体抗炎激素药物合成中不可缺少的一步。

一般情况下，细菌的脱氢能力比真菌强，如棒状杆菌中的节杆菌和分枝杆菌脱氢活力较强。

3-酮基甾体-Δ1-脱氢酶（KS1DH）是微生物体内最常见的脱氢酶。

（该反应被广泛应用于制药工业）

KS1DH可催化Δ4-3-酮甾体的脱氢，其作用是在3-酮基甾体的A环上引入1,2位双键。

KS1DH同时也是甾体母核降解的关键酶，因为甾体母核降解时也需要甾体A环上1,2位双键的引入。

KS1DH可催化脱氢反应的逆反应即C1,2-氢化反应，该酶的氢化活性对底物的特异性类似于3-酮-4-烯甾体的脱氢反应。

甾体边链降解

各类具有生理活性的甾体药物的基本母核目前都是从高等植物和动物中的天然甾体化合物经过边链降解、除去厄长的边链得到基本甾体母核

研究发现，许多微生物都能够将固醇类化合物作为碳源利用，最终将甾体母核环戊烷多氢菲和边链完全氧化为CO2和水。

固醇边链降解的机制与脂肪酸的β氧化途径相似。

胆固醇的边链降解途径始于C27羟基化，再通过氧化形成C27酸，然后β-氧化后先失去丙酸、醋酸，最后脱去丙酸，形成C17酮化合物

9α-羟化酶C1,2-脱氢酶（KS1DH）

如何避免甾体母核的降解

（1）对固醇进行结构改造达到选择性降解甾体边链的目的。

在甾体的A环形成芳香核后不再会发生母核的破裂。

或当C6β-19氧桥存在时会阻碍C1,2双键导入，从而保护甾体母核不