动物转基因与生物反应器思考题.docx

动物转基因与生物反应器思考题.docx

《动物转基因与生物反应器思考题.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动物转基因与生物反应器思考题.docx（15页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

动物转基因与生物反应器思考题

动物转基因与生物反应器思考题

1．转基因动物的概念、主要研究内容以及现状和前景。

（找不到前景）

概念：

将外源基因导入动物的受精卵或早期胚胎细胞，使之整合到动物的基因组并获得表达，由此外源基因能随着细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的动物称为转基因动物。

主要研究内容：

提高动物品种的抗性；提高生长速度；改良动物的适应性；改良动物的生产性状；动物反应器

现状：

同基因重组微生物和转基因植物相比，转基因动物的技术效率很低，费用高，消耗多，产生有用结果耗时长。

概括如下：

①生产转基因动物需要高水平DNA操作

1.到目前为止，真正了解其全部表达调控元件的动物基因只有少数几个。

2.对大多数基因来讲，我们还只能分离它近5′端的启动子，及近5′端和近3′端的增强子。

3.转基因动物的载体已变得相当大，加上目的基因序列，表达结构的总长度一般都在10kb以上，长的可以达到20-30kb。

4.表达仍需受基因插入位点附近染色体环境的影响，产生所谓的基因表达“位置效应”。

②动物转基因技术效率低下

显微注射仍旧是最常用的动物转基因技术。

显微注射DNA不仅需要昂贵的设备和训练有素的操作人员，而且效率低下（按照注射和移植的胚胎数来计算，每生产一只转基因绵羊、山羊或猪，大体需要注射100个单细胞胚胎。

生产转基因牛的效率更低）

生产转基因动物方法，还有精子介导、逆转录病毒载体转染和ES细胞途径等。

2．为什么要研究和应用转基因动物，为什么不能用离体培养的动物细胞取代转基因动物呢？

1.应当认识动物细胞不等同于自由生活的细菌和酵母菌，它是复杂的动物体的基本单元。

因此，当动物细胞离体培养时，它们的许多特性迅速消失。

2.在离体状况下，要维持细胞在体内相同甚至相近的环境条件，也是不可能的。

3.有些基因转入动物细胞系中后，与把它们转入转基因动物中的行为有很大差别。

离体培养的细胞中缺少某些能够通过结合到内含子上而刺激基因表达的组织特异性因子。

4.最为重要的是，利用转基因动物可以研究许多复杂的生物学过程。

3.卵泡发育，排卵和黄体的控制。

①促性腺激素对卵母细胞的发育的影响

卵母细胞在出生后在减数分裂诱导因子的作用下，将染色体减少到单倍体时期。

这一过程在减数分裂到达双线期或核网期时被减数分裂抑制因子阻止。

直到卵泡开始进入最后发育成熟阶段才开始恢复减数分裂。

卵泡发育的起始阶段包括卵母细胞的生长。

同时，卵泡细胞开始分裂并形成数层颗粒细胞。

颗粒细胞分泌另外一种界限物质---透明带，该透明带与颗粒细胞相连并立刻包围卵母细胞。

②促性腺激素受体的形成和作用

为了使卵泡发育越过腔前阶段，颗粒细胞和膜细胞必须表达出促性腺激素的受体。

FSH和LH受体分别在颗粒细胞和膜细胞上表达出来。

促性腺激素受体在颗粒细胞和膜细胞上的出现导致了雌激素合成的细胞间相互作用的形成。

雌激素的作用之一就是随着卵泡的进一步发育促进FSH受体的进一步增加。

③LH受体与排卵作用

有腔卵泡发育的后期，FSH和雌激素促使颗粒细胞中产生LH受体，而FSH受体开始减少。

有腔卵泡雌激素分泌的增加导致促性腺激素排卵前峰的出现。

这样，在发育的最后阶段，卵泡在LH的控制下排卵后开始形成黄体。

成熟卵泡中，颗粒细胞分泌大量的雌二醇，抑制小卵泡的发育，同时大量的雌二醇可以促进排卵前LH高峰的分泌，从而促进排卵。

4.雌激素和GnRH控制雌性动物的性容受性而睾酮控制雄性的性容受性。

不确定ppt

睾酮决定外生殖器和大脑的性别分化

生殖管道系统和外生殖器的发育受发育中的性腺的控制。

如果个体为雌性，即发育的性腺为卵巢，苗勒氏管发育成输卵管、子宫、子宫颈和阴道，而沃夫氏管退化。

引起这两个管道变化的重要因素是睾酮。

如果个体为雄性，则睾丸网产生苗勒氏管抑制因子，它引起沃夫氏管发育，而苗勒氏管退化。

5a-还原酶对于雄激素的作用是非常重要的，因为睾酮必须在细胞内转化成二氢睾酮才能使组织发生雄性化。

在雄性动物中，促性腺激素分泌的控制与雌性的相似。

下丘脑GnRH的波动性释放影响促性腺激素的波动性分泌，后者反过来引起睾丸中睾酮的波动性分泌。

5．下丘脑-垂体如何对生殖的控制？

①下丘脑和垂体前叶激素控制性腺的活动

性腺的活动受下丘脑和垂体前叶的控制。

肽类激素或直接通过神经原轴突到达垂体，或通过垂体门脉系统进入垂体。

垂体对下丘脑肽类激素刺激的反应是产生或分泌对性腺活动有重要作用的激素。

②垂体前叶分泌控制生殖过程的FSH、LH和催乳素

腺垂体（前叶）产生蛋白质激素，对于生殖有重要作用。

其中主要是促性腺激素（FSH和LH），另一种激素是催乳素。

FSH和LH在卵泡发育和排卵中有协同作用。

FSH在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中起主要作用，而LH在卵泡最后成熟和排卵中起主要作用。

神经垂体分泌的催产素也是生殖中的一个重要激素。

③促性腺激素释放的变化

•促性腺激素分泌的主要类型是波动性分泌，这一波动性分泌类型是受下丘脑GnRH的波动性分泌的特征决定的。

•促性腺激素分泌的波动产生系统在卵泡期增加，而在发情周期的黄体期降低。

雌激素降低促性腺激素分泌的波幅，而孕酮降低波的频率。

这种频率增加而波幅下降相结合的特征对于发育中的有腔卵泡最后生长期的营养提供是非常重要的。

•下丘脑和腺垂体对持续升高的雌激素分泌发生的反应，是使促性腺激素分泌增加，这种关系是正反馈关系。

•卵泡能够将自己的成熟状态通过雌激素信号传递给下丘脑和腺垂体，随着卵泡的成熟，雌激素的生成量增加。

•促性腺激素的分泌受卵巢性激素（雌激素和孕酮）的调节。

在一定时间，这些激素对促性腺激素分泌起抑制作用。

•孕酮对促性腺激素波动频率的影响，认为是在下丘脑水平。

而雌激素通过影响垂体和下丘脑两个水平来影响促性腺激素的分泌。

•促性腺激素的分泌能够被下丘脑和卵巢中生产的肽类和蛋白质类激素调节

6． 试述体细胞克隆技术的过程。

①体细胞的制备

②卵母细胞的制备

③体细胞核移植

④胚胎移植

7.列举转基因技术的种类过程及应用？

①显微注射：

使用显微注射器直接把DNA注射到动物的受精卵的原核或细胞质中，然后生产动物个体。

选择小鼠品系（♀×♂）

↓

外源DNA制备收获受精卵准备不育公鼠

↓↓

显微注射的受精卵假孕母鼠

↓

将导入外源基因的受精卵植入假孕母鼠的输卵管或子宫

↓

转基因鼠中外源基因整合的检测

↓

通过繁育建立转基因小鼠品系

要求：

假孕母鼠与移进胚胎的发育阶段同步化，为移植胚胎提供着床和继续发育的生理条件。

优点：

¹外源DNA大小基本不受限制（1-50kb）；导入过程直观。

缺点：

¹设备昂贵、环节较多

¹对操作人员有较高的技术要求　

¹对卵子伤害大，胚胎存活率低

¹低效率（尤其是大家畜，见效率图）

¹基因整合随机性

¹转基因沉默

②反转录病毒载体法

将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的）,获得转基因动物的方法。

优点：

Ø受精卵携带外源基因的阳性率高

Ø外源基因多单拷贝整合

Ø操作简单，避免注射法对卵子的损害

Ø宿主范围广

Ø可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高

缺点：

Ø容纳大小有限，最大长度8Kb，很难克隆全套基因表达元件

Ø潜在致癌性,载体复杂

Ø整合率不高,胚胎自我保护机制对其有抗性

Ø不能控制转染时间，生产出的动物多为嵌合体

③精子介导法

直接以精子为载体的转基因方法。

将成熟精子与外源DNA共培养，成熟精子与外源DNA预培养之后，使精子有能力携带外源DNA进入卵子中，使之受精，并使外源DNA整合到染色体中。

•优点：

可重复性好

•缺点：

稳定性低

•容易出现嵌合体

④胚胎干细胞法（ES细胞法）

将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。

优点：

Ø外源基因整合情况的可控性高　

Ø可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性　

外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便

缺点：

ES细胞系建立及培养困难

维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易

所得个体为嵌合体

8.比较随机整合与同源重组的差异？

随机整合

即使外源DNA含有与某一条染色体广泛同源的序列，大多数整合仍然是随机的，只有少数是通过同源交换而实现重组。

①外源DNA整合的构型

1）.在一个特定的胚胎或一个特定细胞克隆，DNA总是整合在染色体的单一位点，最多整合在少数几个位点上；

2）.在每一个整合位点，外源DNA通常呈现多拷贝串状整合；

3）.在绝大多数情况下，某一位点上多拷贝串状整合的外源基因，采取头尾相连的排列方式

4）.这些方向一致的串状拷贝，是被导入DNA的完整或近乎完整的拷贝，在最坏的情况下，也只有在两个相邻拷贝相结合的地方出现小的不完整；

5）.在稀有的情况下，发现两个拷贝呈现头对头或尾对尾的连结方式，在这种情况下常发生末端缺失。

②外源DNA整合到染色体上的机制

整合常发生在匹配较差的序列之间的不正常交换。

在外源DNA及其染色体上的插入位点之间的结合部，常常包含一段短的DNA序列（所谓填充序列），它明显地既不来自外源DNA，也不来自染色体。

③外源DNA整合时间和转基因嵌合体产生

转基因嵌合体的产生是由于基因整合时染色体已复制，或者已整合的基因从一个子染色体上丢失。

研究结果表明，显微注射DNA的时间越早越好，在用体外受精的方法生产原核胚胎时，更应掌握好及时完成注射的时机。

同源重组

如果外源DNA含有适当的同源区，也可以通过类似的同源重组过程整合到真核生物的染色体上。

DNA通过同源交换整合到染色体上的机制，为向目标基因导入预先设计的突变提供了途径，这种方法通常被称作基因打靶。

①外源基因通过同源重组实现整合

对于使用原核胚显微注射技术生产转基因动物也许意义不大，但对于通过动物克隆方法生产转基因动物的用处可能很大。

②位点专一性重组

•位点专一性重组是通过结合在专一位点上的重组酶分子将参加位点拉扯到一块，从而实现同源交换。

•目前，在转基因工作中常用的两种重组酶属于Lambda整合酶家族：

噬菌体P1的Cre重组酶和啤酒酵母菌的FLP重组酶。

•这两种酶的作用机制是一样的，每一种酶都认识一段34对碱基的DNA序列。

Cre认识的序列称作LoxP，而FLP认识的序列名为FRT。

重组酶的识别序列由核心序列和侧翼序列组成，侧翼序列完全相同但方向相反，是酶的结合位点；由八对碱基组成的核心序列呈不对称性，决定整合位点的方向。

•发生重组时，每条参与重组的双链DNA结合两个重组酶分子，整个反应总共有四个重组酶分子参加，重组过程不消耗能量。

•位点专一性重组是双向的，可以把外源基因整合到染色体上，也可以从染色体上把外源基因剪切下来。

在反应过程中，把两个分子结合在一起，亦即外源DNA整合到染色体上的反应，依赖底物的浓度，而剪切过程不依赖底物浓度。

在生物体内由整合酶催化的剪切反应非常有效，相反，定点整合反应效率较差。

为了改进整合效率，对LoxP序列进行了修饰

9.基因表达的原理与应用

①组织特异性表达

•动物组织的多样性，是由基因的组织特异性表达造成的，这一点早已被证实。

•组织特异性基因表达是通过两种调控机制实现的。

•第一种调控过程是相对短效的调控过程，由出现在表达细胞内的调控因子结合到基因的调控DNA序列上，激活基因表达。

•第二种调控过程是长效调控。

这种调控过程使细胞永久性地处于分化状态，每一种细胞都可以长期维持和记忆它所属的细胞类型的特征，只表达它应当表达的基因。

②染