生物技术制药综合实验报告Word下载.docx
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EGF在狭小的活性微环境中，由于常见的丙氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸[11]会提供作用基团，表皮生长因子才能与受体结合反应。
多肽具有N端和C端，有的在生物活性中不起作用，有的是至少有一段起作用，据研究表明，表皮生长因子结构的两端在细胞的生长中都很重要。
1.3EGF的生物学效应及应用
细胞通过在信号传导的过程中有多种方式包括直接或间接的接触。
自分泌或旁分泌是hEGF作用的方式，在生物体内它亦可以与其他的因子结合作用于细胞。
EGF生物效应很多，如下所述：
1.来源于人体的不同种组织的上皮细胞为了适应人体的需要，从基因上赋予它很高分裂效率。
EGF在其中起着关键性的作用。
首先人体的皮肤表层会产生脱皮现象，证明有大量的细胞死亡。
同样，皮肤的表面受到伤害在愈合的过程会结痂，新的皮肤又长出来了。
EGF在创伤修复中起着功不可没的作用，在肝脏、肠道、角膜、胃等多种组织创伤的恢复的试验研究[12]取得重大的突破，在临床上已经运用于烧伤、烫伤、创伤及外科手术伤口的愈合，使病人的痛苦少一点。
2.眼睛是我们重要的部分，眼睛的部分受到伤害特别是眼角膜，是我们最担心的。
在现实生活中，很多病人由于眼角膜的伤害再加上眼角膜的捐献者少之又少无法得到修复。
实验研究结果表明，适宜浓度的hEGF滴眼液，能通过刺激角膜上皮细胞及基质成纤维细胞的增生与迁移和促进细胞外基质与胶原纤维增生，使损伤修复速度加快，从而辅助修复角膜[13]。
3.研究表明，多数肿瘤的发生、发展，与EGF之间存在一定的关系。
细胞中存在原癌基因和抑癌基因，癌变可能由于这些基因的突变细胞，使细胞生长不受控制。
肿瘤细胞表面的EGF受体属于多聚体受体，多个EGF的表达之后与受体结合，使细胞不停的生长，这样，与胃癌、乳腺瘤、黑色素瘤的恶性程度增加[14]。
4.是药三分毒，我们吃的要中有些药对人的胃刺激很大。
实验表明：
在人的胃溃疡中受损伤的细胞与保护药硫酸铝相结合，可以使溃疡有较高浓度的内源性EGF表达，从而促进溃疡愈合。
1.4本实验课程设计的目的与内容
1.实验课程设计目的：
本实验课程设计重在学生自己动手设计实验，老师起辅助指导作用，旨在训练学生对专业综合知识的运用。
学生需查阅文献和数据库来设计与理解设计方案，主要考察学生对基因分子克隆、表达、发酵和蛋白分离知识的理解与应用，以培养学生的专业综合知识应用与实验动手操作能力。
2.实验课程设计内容：
以表皮生长因子（EGF）为例，让学生从基因的设计入手，合成出完整的EGF基因，然后表达并纯化出该EGF蛋白。
主要内容简述如下：
（1）通过NCBI数据库网站设计出完整的EGF基因，并设计出引物；
（2）pET-28a衍生质粒为载体、将EGF基因转化如大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中，并通过双酶切和PCR挑选验证转化子；
（3）诱导重组大肠杆菌表达hEGF蛋白；
（4）经超声破碎提取、SDS-PAGE电泳检测
（5）采用镍柱纯化，进而获取hEGF蛋白纯品。
第二节EGF基因的合成与转化表达
2.1.实验原理
人源表皮生长因子（hEGF）来源大致有三个方向：
一是来源于人体代谢物的提取；
二是来源于化学合成；
三是来源于基因工程生产技术，这也是近些年来可以大量生产获得hEGF的方法。
前两种方式得到的产品都只有很低的纯度，并不能在实际应用中发挥很大的价值。
。
目前已知的研究中，hEGF基因在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母以及动植物等宿主系统中已经成功克隆表达。
以pET等衍生质粒为载体、以BL21（DE3）为表达宿主菌的表达系统是发展较成熟的大肠杆菌表达系统之一,它采用T7强启动子,在IPTG诱导下,启动外源基因的高转录。
pET载体有pET32a（±
）和pET28a（±
）等系列。
下图1为PET28a质粒载体的物理图谱。
2.2实验材料与方法
2.2.1试剂材料及试剂
琼脂粉、NaCl、蛋白胨、酵母浸粉、1mol/LNaOH溶液、双蒸水、10mg/mlKana母液、PET-28a菌种、E.coliDE3菌种、酒精、含质粒载体的PET-28a菌液、小型质粒快速提取试剂盒（离心柱型）、Goldview、BIOWESTAGAROSE、loadingbuffer（6×
）、HindⅢDNAMarker、TAE电泳缓冲液（1×
）、0.1mol/LCaCl2溶液、ZdeI酶（10U/μl）及其10×
Buffer、Xhol酶（10U/μl）及其BufferD10×
、GenClean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、5U/µ
lTaqDNA聚合酶、PCR缓冲液（10×
，含Mgcl2）、dNTP混合物、上游引物、下游引物、无菌双蒸水、1mol/l的异丙基硫代半乳糖苷（TPTG）、PBS（1×
）、SDS-PAGE蛋白凝胶配制试剂盒：
30%Acr-Bis（29:
1）、1.5MTris-Hcl，pH8.8、10%SDS、10%过硫酸铵（AP）溶液、TEMED、1MTris-Hcl，pH6.8；
2×
上样缓冲液、1×
Tris-甘氨酸电泳缓冲液、考马斯亮蓝染色液、脱色液Ⅰ（45%甲醇：
10%乙酸：
45%蒸馏水）、脱色液Ⅱ（5%甲醇：
7%乙酸：
88%蒸馏水），双蒸水
2.2.2仪器设备
试管、量筒、天平、药匙、称量纸、培养皿、高压蒸汽灭菌锅、恒温生化培养箱、涂棒、接种环、酒精灯、pH试纸、记号笔、麻绳、棉花、报纸、镊子、滴管、10ml移液管、恒温摇床、Eppendorf管、微量移液器、枪头、高速离心机、电泳仪、电泳槽、水平凝胶电泳槽和梳子以及其制胶模块、250ml锥形瓶、微波炉、凝胶成像系统、分光光度计、制冰机、冰盒、恒温水浴锅、超净工作台、水漂、0.2mlPCR微量管、双面微量离心管架、PCR仪、紫外检测仪、脱色摇床、台式冷冻离心机、垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子、1.5ml微量离心管、搪瓷盘
2.3实验方法
2.3.1试剂及培养基配制方法
1.卡那霉素母液（10mg/mL）的配制：
称取10mg卡那霉素溶解于1ml无菌水中，然后采用无菌过滤器过滤后分装于Eppendorf小管中。
2.培养基的配制
（1）LB培养基：
配方（固体培养基加琼脂粉）
1000ml150ml
蛋白胨
酵母浸粉
NaCl
琼脂粉
去离子水
10g1.5g
5g0.75g
18g2.7g
950mL142.5mL
（2）含卡那霉素（Kana）LB固体培养基：
将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Kana储存液，使终浓度为50µ
g/ml，摇匀后铺板。
（3）含Kana的LB液体培养基：
每15mLLB液体培养基分装至试管中，高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Kana母液，使终浓度为50µ
g/ml）
第三节、实验前的准备
3.1目的基因hEGF的设计与合成
（1）目的基因获取
登陆GenBank查询
获得的目的基因片段为：
aatagtgactctgaatgtcccctgtcccacgatgggtactgcctccatgatggtgtgtgc
atgtatattgaagcattggacaagtatgcatgcaactgtgttgttggctacatcggggag
cgatgtcagtaccgagacctgaagtggtgggaactgcgc
3.2载体选择
3.2.1载体选择主要考虑下述3点：
【1】构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】载体的类型：
（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<
10kb选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意3点：
①选择合适的启动子及相应的受体菌；
②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；
③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。
选用质粒（最常用）做载体的4点要求：
①选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；
②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<
10个。
③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；
④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得分子，以便于与目的基因片段进行连接。
根据本实验要求和目的：
通过基因工程技术，将人表皮生长因子基因通过转化、诱导促使大肠杆菌表达人的表皮生长因子，最终分离纯化得到目的物，因此应该选择表达载体，使最终产物方便提纯的载体如含有His-tag。
3.3酶切位点设计
3.3.1载体的结构
图2-1
图2-2
3.2.2酶切位点设计注意以下
（1）酶切位点的设计要使表达通读
（2）前后位点尽量选用相同的酶切buffer和温度
（3）用于表达，一定要保证读码框的正确，是否加起始密码子终止密码子都要根据载体的情况认真考虑。
（4）两个酶切位点最好远点大概20BP左右，不然不好切不好连
酶切位点尽可能选一些效率高的酶，否则你得加一长串的保护碱基
3.2.3酶切位点的确定
经过Blast发现XhoI与NdeI这两个酶切位点在目的基因中都没有；
根据网上相关资料XhoI与NdeI具有相同的缓冲溶液都为10xHbuffer；
具有相同的酶切温度都为37℃；
根据图2-1可以看出两个酶切位点相隔70bp，相隔距离足够远；
考虑到目的产物是利用Ni+亲和层析的方式提取，需要6xHis-tag标签，从图2-2可以看出XhoI酶切位点后紧跟着一个6xHis-tag标签，这个满足后续的分离纯化；
选用XhoI与NdeI位于启动子和核糖体结合位点下（rbs），能够保证目的基因被转录出；
NdeI的酶切位点为5'
CA^TATG3'
，其ATG进转录和翻译对应着起始密码子AUG，可以避免使目的产物发生移码现象，保证了读码框正确性，所以选择了XhoI与NdeI这两个酶切位点，来构建基因表达载体。
3.3引物设计
3.3.1PCR引物设计的基本原则
1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；
2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'
到3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；
4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'
端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'
末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0；
5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。
但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。
如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；
6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段；
7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生；
8、3'
端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'
端最后一个碱基最好不要是A或T，若是，会导致错配；
9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。
选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；
10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高。
因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物；
11、在DNA测序和PCR中最好用5'
末端稳定（GC含量多），而3'
端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；
12、引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。
13、对引物的修饰一般在5'
端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。
3.3.2引物设计
（1）.利用Primer6.0软件进行引物：
验证实验引物
F：
5’-AGTGACTCTCAATGTCCC-3’
R:
5’-TTCCCACCACTTCAGGTCTC-3
其评分为poor，但是该序列只有CDR区，设计引物最好从头开始，不然在PCR的过程中目的基因会被变短。
所以引物为：
Forward：
5’-CGCCATATGAATAGTGACTCTCAATGTCCC-3’
Reverse:
5’–CCGCTCGAGCACGAGTTCCCACCACTTCAGGTCTC-3’
第四节、实验篇
4.1整体实验过程
4.1.1实验整体流程：
（1）利用试剂盒进行XL10质粒提取
（2）对XL10的质粒进行电泳检验、双酶切检验和PCR验证
（3）大肠杆菌（DE3）感受态的制备
（4）大肠杆菌DE3的转化
（5）转化结果结果检验
（6）转化菌种IPTG诱导表达
（7）诱导前后SDS-Page电泳鉴定
（8）利用镍柱对蛋白质进行纯化，得到目的产物
4.1.2简化后的并行流程
由于本实验为一个大型实验，时间限制，我们分组进行实验，老师提供了XL10，已经转化好的DE3和空宿主DE3，所以实验可以进行小组分配，多个模块同时进行，加快实验进度。
4.2、小组结果展示
4.2.1大肠杆菌转化实验结果
转化结果成功，在含卡拉的培养基上成功生长
4.2.2XL10质粒电泳结果显示
跑出的结果为质粒提取成功，条带大小位于5000bp—6000bp
第一个条带为DＬ500，最后一个条带为ＤＬ10000其他均为所提质粒
4.2.3单酶切实验结果显示
从左到右依次为：
DL10000，空载体，提取质粒，提取质粒
单酶切成功：
提取质粒含有目的基因，而空载体不含有目的基因，都经单酶切后，在电泳中的迁移速度不一样，空载体要大于所提取的质粒。
4.2.4PCR结果显示
PCR产物，PCR产物，PCR产物，DL500
PCR条带在maker的150到200条带见
4.2.5SDS-page电泳结果展示
实验结果失败，分析见小组讨论
4.3、个人负责实验模块
个人主要负责第一个大模块——XL10，从质粒抽取到最终的PCR酶切验证。
验证质粒是否提取成功，验证目的基因是否存在与载体上。
4.3.1提取重组质粒
（1）在灭菌后的无菌操作台中，取15ml分装至试管中的、灭菌后的LB液体培养基，加入卡那霉素母液150µ
L，保证它在培养基中为50µ
g/mL。
（2）将含目的基因的重组质粒的穿刺菌XL10接种无菌LB培养基（含50µ
l/mL卡那霉素），37.C摇床过夜培养（不能超过15h）。
（3）取收取的2ml的菌液于2mlEp管中，用于提取质粒。
（4）提取质粒，按质粒小量制备试剂盒操作说明书操作。
4.3.2电泳检测质粒DNA
（1）称取0.3g琼脂粉BIOWESTAGAROSE，放入三角瓶中，加入30mlTAE电泳缓冲液（1×
），制成1%的胶，在微波炉中烧开。
（2）待彻底熔化后，停止加热。
（3）取出三角瓶，自然冷却至不烫手，加入1.7µ
lGoldview染液。
（4）插入梳子后缓缓倒入胶液，至模具的矮边缘即可，平放等待彻底凝固。
（5）在电泳槽里加满1×
TAE缓冲液，调电压至140V（10V/cm）。
（6）胶全凝固后，小心拔出梳子，放入电泳槽中，凝胶要没入缓冲液中。
（7）在塑料片上，点5µ
l（6×
）loadingbuffer，再加入1µ
l上述质粒DNA提取产物，混合均匀。
（8）在凝胶上选择相邻的加样孔，用吸液头分别将管中的样品和DNAMarker加入凝胶的加样孔中。
（9）打开电源，样品以蓝色的横带泳动，电泳约30min。
（10）当蓝色泳动到凝胶边缘1cm时，关掉电源。
取出模具和凝胶放入成像系统中，观察结果图，并保存。
4.3.3双酶切并检测
（1）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。
从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰块中。
（2）用20µ
l的反应体系进行双酶切：
无菌双蒸水14µ
l、10×
HBuffer2µ
l、BSA1µ
l质粒1µ
l混匀，限制性内切酶XhoI、NdeI各1µ
l。
（3）混匀离心管使管中的溶液。
在离心机中5000rpm离心30秒。
取出后插到水漂的孔中，37.C水浴酶切2h。
（4）酶切后取酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳（方法参照上述），制1.5%的琼脂糖凝胶，电泳以确认切下的片断是否为自己想要的片断。
4.3.4EGF基因的PCR扩增验证
取无菌的0.2mlPCR管，置于冰中，在其中添加如下成分如表3：
表3PCR反应体系
无菌水
17µ
l
10×
PCR缓冲液（含Mgcl2）
2.5µ
dNTP混合物
2µ
上游引物
1µ
下游引物
待扩增DNA模板
TaqDNA聚合酶（5U/µ
l）
0.5µ
终体积
25µ
混匀后，稍作离心（如果利用非热盖型PCR仪器，应添加30µ
l石蜡油于反应管中，防止样品水分的蒸发）[17]。
将反应管放入PCR仪，按下列条件设定反应程序，进行PCR反应，如表4：
表4PCR反应过程
94℃预变性5min
变性94℃30s
退火55℃30s循环25次
延伸72℃30s
最后在72℃保温10min
PCR反应结束后，取5-10µ
l反应液做电泳检测，鉴定PCR反应产物是否存在，及其大小。
电泳确认后，PCR产物即可用于下一步操作或冰箱保存。
五、小组讨论篇
5.1质粒电泳检测讨论
（1）本小组开始打算是从已转化的DE3中提取质粒做电泳检测、双酶切和PCR检测。
用试剂盒提取后，跑电泳结果如下图：
实验结果失败只有maker条带。
后经老师的知道和查阅相关资料，发现DE3为表达型宿主，菌种体内的质粒含量较少；
XL10大肠杆菌为酶切系统缺陷型，有利于质粒大量的复制，属于克隆性宿主，因此后面提取改为直接从XL10提取质粒做以上实验。
（2）改为XL10后，按照试剂盒说明书进行质粒抽取，取2ml菌液抽取，电泳上样15ul依然发现条带很淡。
如下图：
经小组讨论决定将提取菌液改为4ml，但是因离心管每次只能容纳1ml菌液，使实验操作时间大大增加，反复讨论，最终确定用灭菌的50ml离心管对菌液进行初步离心，然后倒去大部分上清液，然后用枪打散混匀，取1ml进行抽取，并且上样量改为5ml，改良后的结果如下：
实验结果质粒量大大提高。
5.2酶切条件讨论
（1）开始利用第一次提取的XL10提取的质粒进行，去了3ul质粒，最终发现电泳结果一片空白除了maker，这也就是为什么用进行5.1
（2）改良的原因。
（2）利用浓缩后的菌液提取质粒，我们小组接受上次失败原因和老师的建议，进行单酶切与双酶切进行对比，并且设置质粒浓度梯度
质粒（ul）
1
2
4
6
8
双蒸水（ul）
14
13
11
9
7
其他条件不变，跑出结果如下：
左边一块胶为双酶切，右边一块胶为单酶切
左边一块胶的质粒的量依次为8，6，4，2，1
右边一块胶的质粒的量依次为8，6，4，2，1
发现与没有酶切的结果相似难以判断酶切结果。
（3）继续讨论，在老师的帮助下，我们发现少了空白对照，并且NdeI的酶活性很低，酶切难度很大。
从老师哪里获得了p
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