药理western blotting090812Word文件下载.docx

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10％过硫酸胺（AP）

过硫酸胺0.1g

超纯水1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周。

（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）

1.5mol/LTris·

HCl（pH8.8）

Tris（MW121.14）45.43g

超纯水200ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

0.5mol/LTris·

HCl（pH6.8）

Tris（MW121.14）15.14g

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

30％Acr/Bic（29.1：

0.9）

丙稀酰胺（Acr）29.1g

甲叉双丙稀酰胺（Bic）0.9g

超纯水至100ml

37℃下溶解后，4℃保存。

使用时恢复至室温且无沉淀。

20％Tween20

Tween2020ml

蒸馏水至100ml

混匀后4℃保存。

（二）使用液

单去污剂裂解液（50mmol/LTris·

HClpH8.0，150mmol/LNaCl，1％TritonX－100，100μg/mlPMSF）：

1mol/LTris·

HCl（pH8.0）2.5ml

NaCl0.438g

TritonX－1000.5ml

蒸馏水至50ml

混匀后，4℃保存。

使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50μl）。

0.01mol/LPBS（pH7.2-7.4）

NaCl8g

KCl0.2g

Na2HPO41.15g（含12结晶水为3.49g）

KH2PO40.2g

蒸馏水至1000ml

G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）

考马斯亮蓝G250：

100mg

95％乙醇：

50ml

磷酸：

100ml

蒸馏水至1000ml

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。

0.15mol/LNaCl

NaCl（MW58.44）0.877g

蒸馏水至100ml

高温灭菌后，室温保存。

100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）

BSA0.1g

0.15mol/LNaCl1ml

溶解后，－20℃保存。

制作蛋白标准曲线时，用0.15mol/LNaCl进行100倍稀释成1mg/ml，－20℃保存。

10％分离胶和4％浓缩胶

10％分离胶5％浓缩胶

10ml5ml4ml2ml

超纯水4.0ml1.9ml2.7ml1.4ml

30％Acr/Bic（37.5：

1）3.3ml1.7ml670μl330μl

1.5mol/LTris·

HCl（pH8.8）2.5ml1.3ml—－

1.0mol/LTris·

HCl（pH6.8）－—500μl250μl

10％SDS100μl50μl40μl20μl

10%AP（过硫酸胺）100μl50μl40μl20μl

TEMED4μl2μl4μl2μl

加TEMED后，立即混匀即可灌胶。

（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）

还原型5XSDS上样缓冲液（0.25mol/LTris·

HClpH6.8，0.5mol/L二硫叔糖醇，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油）

0.5mol/LTris·

HCl（pH6.8）2.5ml

二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）0.39g

SDS0.5g

溴酚蓝0.025

甘油2.5ml

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

电泳液缓冲液（25mmol/LTris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％SDS）

1×

4×

Tris（MW121.14）3.03g12.12g

甘氨酸（MW75.07）18.77g75.08g

SDS1g4g

蒸馏水至1000ml1000ml

溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。

（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）

（可以配制成10×

电泳液缓冲液进行保存，稀释10倍使用）

转移缓冲液（48mmol/LTris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇）

1×

2×

Tris（MW121.14）3g5.8g11.6g23.2g

甘氨酸（MW75.07）14.4g2.9g5.8g11.6g

SDS0.37g0.74g1.48g

甲醇200ml200ml400ml800ml

蒸馏水至1000ml1000ml1000ml1000ml

（此溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。

（先用蒸馏水溶解甘氨酸、Tris和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。

如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、Tris和SDS等比较困难）

（可以配制成2×

转移缓冲液进行保存，稀释后使用）

10X丽春红染液

丽春红S2g

三氯乙酸30g

磺基水杨酸30g

蒸馏水至100ml

使用时将其稀释10倍。

TBS缓冲液（100mmol/LTris·

HClpH7.5,150mmol/LNaCl）

1mol/LTris·

HCl（pH7.5）10ml

NaCl8.8g

TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）

TBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）

20％Tween202.5ml

（或Tween200.5ml）

TBS1000ml

混匀后即可使用，最好现配现用。

封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）

脱脂奶粉（国产，安怡牌）5g

TBST100ml

溶解后4℃保存。

使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可，现配现用。

洗脱抗体缓冲液（100mmol/L2-Mercaptoethanol，2％SDS，62.5mmol/LTris·

HClpH6.8）

14.4mol/L2-Mercaptoethanol（β-巯基乙醇）700μl（通风厨里加）

SDS2g

0.5mol/LTris·

HCl（pH6.8）12.5ml

超纯水至100ml

配制时，在通风厨内进行。

4℃保存。

可重复使用1次。

显影液（5X）（显影液或定影液可购买现成包装好的产品再配成相应体积）

自来水（加热至50℃）375ml（以下药品加到温水中）

米吐尔1.55g

亚硫酸钠（无水）22.5g

碳酸钠（无水）33.75g

溴化钾20.95g

补水至500ml

配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。

使用时用自来水稀释至1倍。

定影液

自来水（50～60℃）700ml（以下药品按顺序加入前者溶解后再加后者）

硫代硫酸钠240g

亚硫酸钠（无水）15g

冰乙酸12.6ml

硼酸7.5g

钾明矾15g（水温冷至30℃以下时再加入）

加水定容至1000ml，室温保存

（不需要自己配制，有钱的直接买柯达的显影液，上千；

没钱的到专业的照相器材市场购买即可，很便宜，一包5毛钱左右）

抗体

用TBST（或牛奶封闭液）稀释至一定浓度使用，每张膜需0.5ml

建议使用杂交袋（小商品市场购买，很便宜，可以多买一点，但是务必注意质量，千万不能漏，不然抗体就浪费了，在使用之前先检查一下杂交袋的完整性）

化学发光试剂

操作步骤

（一）蛋白样品制备

（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：

1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一

会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。

2、每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。

平放轻轻摇动1min洗

涤细胞，然后弃去洗液。

重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将

PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

3、准备好含0.5%DTT、1%PMSF的裂解液A，摇匀置于冰上。

（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。

）

4、每瓶细胞加500μl含0.5%DTT、1%PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。

5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将

细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行。

6、于冰上超声破膜10秒×

3次，每次间隔30秒，电压约80V。

7、超速离心，32000转/分钟，4℃，60分钟。

（注意用PBS配平）

8、吸取上清液240μl，加5×

上样缓冲液60μl，混匀，沸水变性3分钟，置于—30℃保存；

剩余上清液作为测蛋白浓度用。

——胞浆成分蛋白

9、沉淀部分加含0.5%DTT、1%PMSF、Triton的裂解液B，冰上裂解30分钟，每10分钟振荡1次。

结束后10000rpm离心5min。

（提前开离心机预冷）

10、吸取上清液，操作同8。

——颗粒性成分蛋白

（个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶50ml的细胞有时按照实验要求只能加100-200μ的裂解液，按照上述操作，直接用200μ裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。

本人是先用预冷的PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋白的，可以放在同一试管，离心后再将蛋白转移到EP管中，这样可操作性就比较强）

（2）组织中总蛋白的提取：

1、将少量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

2、加400μl单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。

然后置于冰上。

3、几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。

4、裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：

由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按

（一）操作外还应收集培养液中的细胞。

以下是培养液中细胞总蛋白的提取：

1、将培养液倒至15ml离心管中，于2500rpm离心5min。

2、弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。

弃上清后用PBS重复洗涤一次。

3、用枪洗干上清后，加100μl裂解液（含PMSF）冰上裂解30min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。

4、将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于－20℃保存。

（二）蛋白含量的测定（按照说明书，最好用酶标仪）

（三）SDS－PAGE电泳

（1）清洗玻璃板：

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。

（2）灌胶与上样

1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

（可以用1%琼脂糖在垂直电泳槽的左、右和下部封边，五分钟后重复一次，这样可以保证基本不漏胶

2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。

（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。

操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。

3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。

再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4、按前面方法配4％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。

插梳子时要使梳子保持水平。

由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。

待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

5、用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。

（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。

若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。

6、测完蛋白含量后，计算含50μg蛋白的溶液体积即为上样量。

取出上样样品至0.5ml离心管中，加入5×

SDS上样缓冲液至终浓度为1×

。

（上样总体积一般不超过15μl，加样孔的最大限度可加20μl样品，据说最大可加到50μl）上样前要将样品于沸水中煮5min使蛋白变性。

7、加足够的电泳液后开始准备上样。

（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，不能高于外侧大玻璃板。

）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。

将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。

（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。

加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

（3）电泳

电泳时间一般4～5h，电压为40V较好，也可用60V（80V×

30min，此时溴酚蓝前沿出浓缩胶，然后100V×

40分钟，此时前沿快跑出分离胶）。

电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

（四）转膜

（1）转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的硝酸纤维素膜。

切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。

将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2h才可使用。

（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。

这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。

若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。

（2）在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

（3）将夹子打开使黑的一面保持水平。

在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。

（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。

）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（4）要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。

撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。

（撬时一定要小心，玻板很易裂。

）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。

小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。

将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。

在膜上盖3张滤纸并除去气泡。

最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。

整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。

膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路（最后做成的“三明治”千万不能形成短路，不然有可能会短路烧坏转膜装置）。

（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。

（5）将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。

电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。

一般用60V转移2h或40V转移3h。

（6）转完后将膜用1×

\u20029X春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。

然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。

将膜晾干备用。

（五）免疫反应

（1）将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

（2）将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5ml离心管中）；

撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；

将抗体溶液加到保鲜膜上；

从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；

室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；

再用TBS洗一次，10min。

（3）同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；

再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。

（六）化学发光，显影，定影

（1）将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；

1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；

1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。

（2）在暗室中，将1×

\u26174X影液和定影液分别到入塑料盘中；

在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；

打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；

根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；

曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。

显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；

显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；

用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

应注意的是：

显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对

结果产生影响。

（七）凝胶图象分析

将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

Westernblotanalysis-1Cellswereculturedin199mediumwith10%fetalbovineserum.After

digestionwith0.25%trypsinand0.2%EDTA,thecellswerecollectedandwerewashedthree

timeswithice-coldPBS,thenwerelysedinbuffer（50mMTris-HCl,pH8.0,150mMNaCl,100μ

g/mlPMSF,1%TritonX-100）for30minatice.Afterremovalofcelldebrisby

centrifugation（12,000g,5min）,theproteinconcentrationoflysateswasmeaturedbyBradford

method.50μgproteinsofdifferentgroupsboiledfor5mininsamplebufferandwereseparated

in10%SDS-PAGEandtransferredontonitrocellulosemembrane（Bio-Rad）.Nonspecific

reactivitywasblockedbyincubationovernightat4℃inbuffer（10mMTris-HCl,pH7.5,150mM

NaCl,2%Tween-20,4%bovinesreumalbumin）.Themembranewasthenincubatedwithprimary

antibody.Thesecondaryantibodywasusedtodetectedboundprimaryantibody.Reactiveprotein

wasdetectedbyECLchemiluminescencesystem（Amershampharmaciabiotech）.

Westernblotanalysis-2TheproteinexpressionezrinwasdetectedbyWesternblotmethod.

Confluent150cm2flasksofcellswerewashedthreetimeswithice-coldPBS,thenlysedin

buffer（50mMTris-HCl,pH8.0,150mMNaCl,100μg/mlPMSF,