细胞生物学实验指导Word格式.docx
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①D-Hanks原液：
分别称取NaCl80.0g、Na2HPO4.2H200.6g、KCl4.0g、KH2PO40.6g、NaHC033.5g，加三蒸水溶解至l000mL。
配制时要注意按顺序逐一加入溶解，应等前一种药品完全溶解后再加下一种药品，原液配好后应分装于250mL或500mL玻璃瓶中，高压灭菌，置冰箱内贮存。
②D-Hanks工作液：
取D-Hanks原液l00mL，加三蒸水896mL，再加0.5％的酚红溶液4mL混合均匀即成。
4．0.25％胰蛋白酶（pH7.2-7.6）：
称取活性为1：
250的胰蛋白酶0.25g，另准备D-Hanks工作液100mL。
先用少量D-Hanks工作液将胰蛋白酶粉调成糊状，再将剩余的D-Hanks工作液全部加入，充分搅拌使酶充分溶解，必要时可将容器置于36℃恒温水浴箱中，直至酶液清亮，再用NaHCO3调pH至7.2-7.6。
然后用玻璃滤器除菌，分装于灭菌后的EP管中，密封后置冰箱冷冻室（-18℃）中贮存。
六、实验方法
（一）实验过程中无菌操作的要求
1．培养用品的清洗消毒：
实验中所需的玻璃器皿（如培养瓶、离心管、吸管、小瓶等）和器械（如剪刀、镊子等）应彻底清洗干净，干燥后用牛皮纸包好置高压蒸汽消毒锅中消毒灭菌（蒸汽压力为103kPa，20min）。
而培养液、PBS液、胰蛋白酶液、PBS液等应利用抽滤法除菌。
将已消好毒的实验所需物品收集并清点好置于超净工作台内，避免实验开始后再从工作台外取物而受污染。
为操作时方便，工作台内的用品应合理布局，原则是右手使用方便的用品放在右侧，左手使用方便的用品放在左侧，酒精灯放在中央。
2．超净工作台的消毒：
超净工作台在使用前可用75％酒精纱布将其内部揩擦一变进行初步消毒，然后打开工作台内的紫外线灯照射消毒20-30min。
照射杀菌完毕后关闭紫外线灯并同时打开风机，由于进入工作台内的空气是经过工作台上的除菌滤板过滤的，故工作台内是一个相对无菌的环境。
3．手的消毒：
操作时双手及前臂要伸入超净工作台内，事先双手必须用肥皂刷洗干净，然后用75％的酒精棉球擦拭消毒。
在夏季，手的刷洗和消毒应至肘部；
在冬季，双手消毒后进入工作台前应戴上无菌的袖套。
4．操作过程中的消毒：
在超净工作台中开始操作时首先应点燃酒精灯，此后的一切操作如打开或加盖瓶塞、安装吸管皮头、使用吸管、使用各种金属器械等均要经酒精灯的火焰烧灼或在火焰旁边进行操作。
培养操作时，动作要准确教捷，不能用手触及器皿的消毒部分，如不慎触及，要用火焰消毒或更换。
开盖的培养液或培养用瓶应尽量保持斜位放置或平放，以避免瓶口长时间直立而增加细菌污染的机会。
吸取不同液体时应分别使用不同的吸管，不要混用以防扩大污染。
（二）细胞的传代培养
当培养瓶中的细胞已长成致密单层时即可进行传代培养，其操作步骤如下。
1．准备：
①将所需培养用具清洗消毒后放入超净工作台内并摆好，紫外线消毒30min。
②将已形成致密单层细胞的培养瓶从培养箱中取出放入超净工作台中。
③点燃酒精灯，在酒精灯旁将培养液倒入一小烧杯中。
2．消化：
①向培养瓶中加入消化液（0.25％的胰蛋白酶）500μL，轻摇培养瓶，使消化液湿润整个细胞单层，置室温下2-3min。
②翻转培养瓶使其底部朝上，用肉眼察看细胞单层，如细胞单层上出现空隙（约针孔大小）时即可倒去消化液；
如果末见空隙，说明消化程度不够，可将消化时间稍延长；
如果发现细胞已大片脱落，说明已消化过，在这种情况下不能倒出消化液，而应直接进入下步操作。
3．终止消化：
往培养瓶中加入3.5mL培养液以终止胰蛋白酶的消化作用，用吸管吸取瓶中的培养液反复冲击瓶壁上的细胞，直至全部细胞被冲下，轻轻混匀制成细胞悬液。
4．计数：
吸取少量细胞悬液于细胞计数器的小室中，光镜下计数，根据结果将细胞浓度调整至5×
105/mL（细胞接种的密度亦可根据经验进行）。
5．传代：
吸取2mL细胞悬液移入另一培养瓶中，原培养瓶中留下2mL细胞悬液（其余弃去），并向每瓶中加入新培养液4mL，盖好瓶塞，轻轻摇匀后置37℃恒温箱中培养。
6．观察：
传代后每天应对培养的细胞进行观察，若细胞贴壁存活则称为传了一代，如培养液变酸发黄要及时更换。
七、注意事项
在整个细胞体外培养过程中，要始终保持无菌的概念，在操作的众多环节中要注意消毒灭菌，努力做到最大限度的无菌，严防细菌的污染，否则将导致细胞培养的失败。
八、实验报告
写出细胞传代培养的实验记录。
并记录传代培养后的贴壁细胞的生长情况。
九、思考
1．在细胞培养过程中，培养液的颜色为什么会变黄？
2．在细胞培养的过程中避免污染的关键环节有哪些？
实验二绿色荧光蛋白重组质粒的细胞转染
1．了解细胞转染的实验原理
2．掌握细胞转染的方法
常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
后者也称稳定转染，外源DNA既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。
外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；
新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。
一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊。
除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高。
其中聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）是一种多用途的转染试剂对各种贴壁细胞有较高的转染效率、也适用于转染悬浮细胞和原代细胞。
可用于转染大分子DNA、小分子寡核苷酸和siRNA等。
PEI是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”（protonsponge）体。
这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞。
大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。
目前在设计更复杂的基因载体时，PEI经常作为核心组成成分。
本研究即取传代培养后细胞融合率在70%-90%的HepG2细胞，将构建好的含有绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因标记的重组质粒，转染细胞并使细胞表达EGFP报告基因。
体外培养的人肝癌HepG2细胞株。
带有EGFP报告基因标记的质粒。
四、实验试剂
无双抗的PBS缓冲液，无双抗15%血清DMEM，胰酶，无血清无双抗的DMEM培养液。
五、实验方法
细胞转染操作（以6孔板或35mm细胞培养皿为例）
1．待细胞长至75%密度时（此时效果为最佳），准备转染。
2．取A、B两个EP管，分别加入100μl无血清无双抗DMEM，A管中加入8μLPEI转染试剂，B管中加入4μgDNA，分别孵育5min。
3．将A、B混合（A加入B中），用移液枪吹打混匀，复合物孵育15min。
4．取待转染的细胞，弃掉旧的培养液，用无血清无双抗DMEM清洗细胞两次（注意清洗时动作要轻），每孔中补加1.8mL无血清无双抗DMEM。
5．将PEI-DNA复合物逐滴滴加到细胞表面，边滴加边轻晃细胞培养板。
6．4h后更换2mL含有血清的培养液。
7．24h后检测细胞内绿色荧光蛋白的表达情况。
六、注意事项
转染实验的成败与众多因素的影响有关，包括细胞状态、血清选择、抗生素的加入、转染用质粒的启动子的选择、质粒提取的质量、试剂保存等等。
①细胞状态：
对于体细胞系建议传代细胞传到第三代左右时就进行转染，取对数生长期状态良好的细胞。
根据细胞类型和培养基类型，选择合适的稳定的培养温度、湿度和CO2浓度，整个实验过程需要严格的无菌操作，防止细胞污染。
②血清选择：
选择质量稳定的血清。
尽量在无血清条件下进行转染，转染效率会比较高。
转染后换成新鲜的培养基进行细胞培养，可以有效提供细胞的存活率。
③抗生素的加入：
在转染培养基、细胞铺板培养基、稳定转染时的选择性培养基中避免使用抗生素，否则转染效率会受到很大的影响。
七、实验报告
于转染后24h观察转染了表达绿色荧光蛋白质粒的细胞转染情况，对实验结果进行描述，并进行讨论。
实验三细胞内参基因的RT-PCR检测
掌握RT-PCR实验技术的原理及操作
GAPDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）的英文缩写。
该酶是糖酵解反应中的一个酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa。
该酶基因为持家（housekeeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，故被广泛用于RT-PCR、Westernblot等实验操作的标准化内参。
本实验以人的肿瘤细胞株为研究材料，通过逆转录-聚合酶链反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction,RT-PCR）的技术手段检测细胞中内参基因GAPDH的表达情况。
RT-PCR的原理是：
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
传代培养的人肝癌细胞株HepG2
PCR仪，水浴锅，各种量程的移液枪，吸头，EP管，试剂瓶，量筒，容量瓶，试管架；
冰块。
DEPC（焦炭酸二乙酯），氯仿，甲醇，乙醇，EDTA，TRIzol，琼脂糖。
反转录试剂盒试剂组成：
M-MLV（反转录酶）EnzymeMix，2×
ReactionMix，Oligo（dT）18。
PCR反应试剂盒组成：
0.1UTaqPolymerase/μL，500μMdNTP，20mMTris-HCl（pH8.3），100mMKCl，3mMMgCl2。
（一）实验器具的处理与准备
1．塑料制品：
（包括枪头、EP管、匀浆管等）
先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压蒸汽灭菌一次（EP管）。
2．玻璃制品：
泡酸过夜，冲洗干净，锡纸包装烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡0.1%DEPC过夜，再烤干）。
（二）实验试剂的配制：
1．DEPC水：
吸出1mLDEPC放在1000mL双蒸水中配成DEPC水，放在1000mL容量瓶中静置4h备用。
2．75%乙醇：
用无水乙醇与DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压蒸汽灭菌30min以灭活其毒性）。
3．异丙醇：
放入棕色瓶中。
4．氯仿：
放入棕色瓶中。
5．上样缓冲液：
0.25%溴酚蓝，30%甘油，6×
缓冲液，4℃保存
6．1.0%琼脂糖凝胶的配制：
1.0g琼脂糖100mL电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/mL溴化乙锭2.5μL，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。
（三）实验具体流程
1．RNA提取
①用冰预冷PBS冲洗培养瓶中的细胞，每孔加入1mLTRIzol反复吹打充分裂解细胞并收集细胞于1.5mL离心管中，室温静置5min；
②每管加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置2-3min；
③于4℃，12000r/min离心15min，将上层水相转移至新离心管中，加入500uL异丙醇轻轻颠倒混匀，静置10min；
④于4℃，12000r/min离心10min，弃去上清，得到RNA沉淀；
加入1mL75%乙醇振摇以清洗沉淀；
12000r/min离心10min，弃上清得沉淀物；
⑤干燥后，加适量DEPC水溶解沉淀，取少量用于RNA浓度和纯度的测定（于紫外分光光度仪下分别测定样品在260nm和280nm波长下的的吸光度并计算A260/A280比值，1.8-2.0为RNA纯度较好时的A260/A280比值）及RNA凝胶电泳鉴定，剩余RNA保存于-80℃冰箱用于RT-PCR的检测。
注意事项：
避免RNAase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染。
建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套，实验相关耗材应用0.1%DEPC水溶液在37℃处理12小时，并高压灭菌30min后使用。
2．反转录（本实验选用First-StrandcDNASynthesis试剂盒，注：
根据预实验结果，实验周使用的试剂盒可能有所变动，试剂加样量和实验步骤有略微差别，实验原理不变）。
反转录具体操作方法如下：
①将各组分溶解，点甩离心，并置于冰上备用。
②根据以下表格配置反应体系，总体积为20μL
试剂
加入体积
RNATemplate
2μL（0.1ng-2μg）
Oligo（dT）18
1μL
2×
ReactionMix
10μL
EnzymeMix
RNase-freeWater
6μL
Total
20μL
③涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
④反应条件为42℃温浴30min；
85℃，5min结束。
⑤反应结束后，若将逆转录产物置于-20℃，可长期保存。
3．PCR反应
PCR反应试剂盒为由TaqDNAPolymerase、PCRBuffer、Mg2+、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂组成的预混体系，浓度为2×
，具有操作简快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好的优点，可最大限度地减少人为误差和污染。
①PCR反应体系
试剂
20μL反应体系
模板
1-2μL
SensePrimer（10μM）
AntisensePrimer（10μM）
MasterMix
RNase-Free水
补水至20μL
②PCR反应条件
步骤
温度
时间
预变性
95℃
3min
变性
30s
25-35个循环
退火
55-62℃
延伸
72℃
终延伸
5min
③结果检测：
试剂盒中的产品已加入染料（蓝色）；
反应结束后取5-20μl反应产物直接电泳检测结果，无需再使用上样缓冲液。
①一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃，退火时间一般为30-60s，无法得到理想的扩增效率时，适当降低退火温度；
发生非特异性反应时，提高退火温度，由此优化反应条件。
②延伸时间根据所扩增的片段大小设定，试剂盒中所含的TaqDNAPolymerase的扩增效率为1kb/30s。
③可根据扩增产物的下游应用设定循环数。
循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。
所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。
④注意避免有毒、有害试剂伤害自己和他人：
氯仿、溴化乙锭（EB）、紫外线等。
⑤注意避免试剂污染。
⑥始终注意避免RNA酶的污染。
⑦保管好自己专用的试剂，公用试剂保管好，相互协调，注意实验室卫生。
绘制PCR电泳检测结果，并针对实验过程和影响实验结果的因素进行讨论。
实验四细胞膜的渗透反应
1．了解细胞膜对物质通透性的一般规律:
细胞膜的渗透性及各类物质进入红细胞的速度。
2．了解溶血现象及其发生机制。
细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。
它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。
各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。
渗透作用是细胞膜的主要功能之一。
将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。
将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对某些溶质具有通透性，溶质可进入细胞内，导致膜内渗透压升高，胞外的水随之进入细胞内，发生溶血现象。
因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞进度的一种指标。
本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化，判定红细胞对不同物质的通透性如何。
三、实验材料
鸡血
50mL小烧杯、10mL移液管、试管（15mL）、试管架。
抗凝剂：
肝素（5µ
g/mL）
0.17M氯化钠
0.17M氯化铵
0.17M醋酸铵
0.17M硝酸钠
0.12M草酸铵
0.12M硫酸钠
0.32M葡萄糖
0.32M甘油
0.32M乙醇
0.32M丙酮
（一）鸡红细胞悬液
以肝素液湿润5ml注射器内壁，推出多余的肝素液（针头内必须留下肝素液，不要进空气），取鸡的静脉血2mL左右。
取50mL小烧杯一只，加一份鸡血和十份0.17M氯化钠溶液，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的鸡血。
（二）低渗溶液
取试管一只加入10mL蒸馏水，然后再加入1mL稀释的鸡血，混匀，注意观察溶液的颜色变化，由不透明的红色逐渐澄清，红细胞发生破裂，造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。
（三）鸡红细胞的渗透性
1．取试管一只，加入0.17M氯化钠溶液10mL，再加入1mL稀释的鸡血，轻轻摇动，注意是否有颜色变化？
是否有溶血现象？
为什么？
2．取试管一只，加入0.17M氯化铵溶液10mL，再加入1mL稀释的鸡血，轻轻摇动，注意是否有颜色变化？
若发生溶血，记下时间（自加入1mL稀释鸡血到溶液变成红色透明澄清所需时间）。
3．分别在下列八种等渗溶液中进行实验，步骤同2。
①0.17M醋酸铵
②0.17M硝酸钠
③0.12M草酸铵
④0.12M硫酸钠
⑤0.32M葡萄糖
⑥0.32M甘油
⑦0.32M乙醇
⑧0.32M丙酮
1．肝素用量要适宜，过少无抗凝作用，过多易导致溶血。
2．为了保证实验结果的精确性，应准确计时，并确定开始计时的标准和完全溶血的标准。
3．有的溶液不发生溶血，有的发生溶血时间比较长，可以将他们与对照组（氯化钠组）一起对比，如果发现有溶血现象但尚未完全溶血的说明该溶液可使血细胞发生溶血，只是时间未到，但是如果与对照无差别，说明它不会使血细胞溶血。
将观察到的现象记录，并进行分析比较和讨论（填写表格）。
管号
处理
是否溶血
时间（单位）
结果分析
1
10ml氯化钠＋1mL稀释鸡血
2
10ml氯化铵＋1mL稀释鸡血
3
10ml醋酸铵＋1mL稀释鸡血
4
10ml硝酸钠＋1mL稀释鸡血
5
10ml草酸铵＋1mL稀释鸡血
6
10ml硫酸钠＋1mL稀释鸡血
7
10ml葡萄糖＋1mL稀释鸡血
8
10ml甘油＋1mL稀释鸡血
9
10ml乙醇＋1mL稀释鸡血
10
10ml丙酮＋1mL稀释鸡血
红细胞在不同溶液中溶血时间为什么不同？
实验五中等纤维免疫荧光染色定位观察
1．掌握细胞免疫荧光染色法的原理
2．了解荧光显微镜的使用方法
真核生物细胞质中的骨架
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