法医物证学各章知识整理Word格式.docx
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选择符合自由组合律的遗传标记]
位于不同染色体上
在同一染色体上相距较远的位置
通过群体调查证实没有遗传连锁关系（基因座独立性检验）
母系遗传（线粒体DNA）:
（1）遗传物质位于细胞质中，不受核移植的影响
（2）无
有丝分裂和减数分裂的周期变化（3）子代只表达母方的特征
应用：
母系进化研究，缺乏父亲的亲子鉴定，其他
男性伴性遗传（Y染色体DNA）:
（1）Y染色体非重组部分的DNA序列
（2）连锁遗
传（以单倍体形式遗传）（3）只遗传给男性子代
父系进化研究，缺乏母亲的亲子鉴定，性犯罪连锁（linkage）:
每个染色体上必然集合着许多基因，基因的这种集合叫连锁。
完全连锁（completelinkage）:
同一条染色体上的两个非等位基因，在遗传过程中完
全不分离的遗传现象
群体：
包含同一物种所有的个体。
Hardy-Weinberg群体：
在一定地域内一群随机婚配，能实现基因世代传递并保持稳
定的许多个体的集群。
genePool（基因库）：
一个群体内所包含的全部基因的总和
遗传多态性（geneticpolymorphism）:
对一个群体而言，控制遗传标记的基因座上存在有2个或2个以上等位基因，并且等位基因的频率大于0.01o
基因频率：
群体中某等位基因数目占该基因座上所有等位基因总数的百分比。
基因型频率：
群体中某基因座上的基因型在全部基因型中所占百分比
表型频率：
就某一性状而言，某一表型在群体中所占百分比
Hardy-Weinberg平衡定律：
①群体无限大；
②随机婚配；
③没有突变；
④没有大规模的迁移和没有选择因素的影响。
结论是群体中的基因频率和基因型频率在逐代传递中保持不变。
Hardy-Weinberg平衡定律的意义：
1•反映基因频率和基因型频率的关系2•群体样本
的检验。
连锁平衡（linkageequilibrium,LE）:
位于不同染色体的基因座，或者位于同一染色体相距较远的基因座之间常常是按照随机原则进行组合的，呈不连锁遗传。
这种基因座之间
没有相关性的状态称为连锁平衡
连锁不平衡：
在遗传过程中，如果不同基因座上的等位基因没有按照孟德尔自由组合定律的随机原则组合时，这些基因座的遗传则处于一种连锁不平衡状态。
杂合度（heterozygosity）:
群体中某遗传标记所有基因型中杂合子所占的比例。
个人识别率（probabilityofdiscriminationpower,DP）:
在群体中随机抽取两个体，两者的遗传标记表型不相同的概率。
非父排除概率（excludingprobabilityofpaternity,PE）:
指孩子的非亲生父亲的男子，能够被某个遗传标记系统排除的概率。
第三章DNA多态性的分子基础
DNA的分子结构：
一级结构是指DNA分子中核苷酸的排列顺序（3'
5'
-磷酸二酯键，
方向：
5'
端t3'
端）；
二级结构是指两条DNA单链形成的双股螺旋结构；
三级结构则是指双链DNA进一步扭曲盘旋形成的超级螺旋结构。
寡核苷酸：
是二至几十个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性核苷酸片段。
寡核苷
酸可由仪器自动合成，可作为DNA合成的引物（primer）、基因探针（probe）等，在分子生物学研究中具有广泛用途。
探针[probe]:
标记有示踪物的寡核苷酸片段。
通过与靶DNA特异性结合（杂交），检
测靶DNA分子。
弓I物[primer]:
与模板DNA结合，引发DNA的合成反应中合成链的延伸反应。
DNA分子的理化性质：
（一）核酸的高分子性质：
粘性酸碱性紫外吸收
（二）DNA的变性和复性：
变性复性降解④杂交
DNA变性[denaturation]:
在一定条件下，碱基间氢键被打开，互补DNA双链变为两条
单链的过程（变性因素：
加热、溶液碱性、有机溶剂）
增色效应：
在热变性的过程中，随变性温度升高，DNA的紫外吸收增强，A260值升高
融链温度（meltingtemperature,Tm）:
融链曲线的中点所示温度。
是一半DNA发生变性时的温度。
Tm的高低反映了DNA分子的热稳定性程度的高低（C+G含量越高Tm越高，高离子强度可以增加溶液中DNA分子的稳定性）。
降解：
DNA分子的共价键断裂，形成多个分子量更小的片段的过程（法医学意义：
高度降解的DNA片段，有可能使待测遗传标记发生破坏，而失去检测的价值）。
DNA复性：
变性因素撤除后，原变性的两条互补单DNA链通过碱基配对重新结合为
双链DNA的过程
退火：
加热后变性的DNA在温度降低过程中的复性。
复性的影响因素：
1、复性温度：
①高：
不易形成氢键，不易发生错配，特异性高。
②低：
氢键容易形成，
易发生错配，特异性差。
参考温度：
Tm值下25C
2、离子强度：
离子可以中和单链DNA分子中所带的负电荷，促进单链DNA分子之间
的聚合
错配率高、特异性差②低：
错配率低、特异性高
3、①DNA分子大小②DNA分子序列复杂程度③DNA分子浓度
杂交：
在复性条件下，来源不同、但具有同源性的DNA单链按碱基配对原则形成双链
DNA分子的过程。
杂交条件的选择：
杂交条件
温度
离子强度
杂交效果
高强度
高
低
错配率低，特异性高
低强度
错配率咼，特异性差
基因组（
genome）:
细胞中所有
DNA的总称。
突变：
遗传物质发生可遗传的变异。
端粒（telomere）:
线性形式基因组DNA的末端都有一种特殊的结构，是一段DNA和
蛋白质形成的复合结构，叫做端粒。
基因突变的分类：
生物体的基因组DNA并不稳定，经常会出现各种各样的可遗传的改变，在子代留下变异的遗传信息。
在DNA分子水平，DNA损伤的后果之一就是突变
编码区突变：
非编码区DNA没有表达产物，DNA复制中也能够出现碱基的错配、插入和
缺失，但是对细胞正常生理过程不构成实质性影响。
无论在编码区或非编码区，突变的后果
从没有效应到有害效应和有利效应，各种情况都会出现。
-碱基替换：
碱基转换、碱基颠倒
「碱基序列改变£
基因突变-•碱基排列改变：
倒位、易位
碱基数目改变：
插入、缺失、重复
同义突变（samesensemutatior）:
是指DNA组成变了，但密码子没有改变，或密码子虽然不同，但编码产生同一种氨基酸，这种突变又称中性突变。
错义突变（missencemutation）:
是指DNA组成改变使编码一种氨基酸的密码子改变成编码另一种氨基酸的密码子。
无义突变（nonsensemutation）:
是指某一碱基的替换使氨基酸密码子变为终止密码，可过早地终止转录，形成无活性的肽链。
移码突变（frameshiftmutation）:
DNA链上插入或缺失一个或n个核苷酸，使下游密码子阅读框发生变化，导致在插入或缺失部位以后的编码发生相应改变。
终止密码突变：
是DNA分子中的某一终止密码突变为编码氨基酸的密码子，从而使多肽链的合成至此仍继续下去，直至下一个终止密码为止，形成超长的异常多肽链。
沉默突变（silentmutation）:
仅改变表达产物的单个氨基酸，对蛋白质的生理功能没有
影响的点突变，是形成蛋白质多态性的主要原因。
DNA多态性：
基因组中，由不同碱基构成的等位基因所形成的多态性叫做DNA多态
性
DNA长度多态性：
同一基因座上各等位基因之间的DNA片段长度差异构成的多态性
可变数目串联重复序列VNTR:
通常把小卫星DNA中的可变数目串联重复序列称
为VNTR
短串联重复序列STR:
把微卫星的可变数目串联重复序列称为短串联重复序列STR。
是目前在法医物证学中应用最广泛的长度多态性遗传标记。
它的重复单位短，仅1-6bp，其
长度多态性来源于重复单位串联重复次数的个体差异。
4bp重复的STR基因座最常用。
筛选STR基因座的条件：
①等位基因长度在300bp以下；
②重复单位为四核苷酸，
不含有插入的非重复单位碱基；
③等位基因数8〜12个；
④基因座杂合度0.8以上，个
体识别能力大于0.9;
⑤基因频率分别比较平均，没有特别高的或特别低的频率的等位基
因；
⑥PCR扩增温度，突变率低。
单核苷酸多态性（SNPs）:
在人类基因组范围内，如果任何单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基其中最少的一种在群体中的频率不少于1%，就形成单核苷酸多态性。
第四章DNA长度多态性
限制性片段长度多态性分析（RFLP）：
RFLP分析是一种传统的分子生物学检测技术，
广泛应用于突变分析、基因诊断、基因定位等各个方面。
法医物证鉴定应用RFLP技术主要
是对人类基因组中的VNTR基因座进行分型，其技术核心是DNA分子杂交，决定RFLP分
析图谱个体特异性的因素是限制性核酸内切酶的特异性和探针的特异性。
检测所用的探针多
是由人类基因组DNA中筛选出的小卫星序列，选择特异性不同的探针，在不同的杂交条件下，可以只检出单个VNTR基因座，也可同时检出多个VNTR基因座，前者称为|DNA纹印，后者称之为DNA指纹，检测所用的相应探针分别被称为单基因探针（single-locusprobe）
禾和多基因探针（multi-locusprobe）。
基本技术：
①DNA提取、纯化和定量②限制性核酸内切酶酶切③电泳分离④印迹转移⑤探针选择一单基因座探针（DNA纹印），多基因座探（DNA指纹）⑥探针标记⑦分子杂交⑧谱带显示
限制性酶选择要求：
①识别序列位于VNTR两侧，尽量靠近VNTR；
②酶活性、特
异性稳定，反应条件容易控制；
③不受基因组DNA是否甲基化的影响。
聚合酶链式反应（PCR）：
类似半保留复制，在体外以基因组DNA为模板，以一对寡核苷酸为引物，dNTP为原料，在TaqDNA聚合酶的催化下，经过变性、退火和引物延伸三步循环使目标片段得到复制百万倍。
PCR反应体系：
①模板DNA②寡核苷酸引物，③dNTP,④反应缓冲
液，⑤TaqDNA聚合酶。
循环参数：
温度、时间
PCR技术特点：
①灵敏度高②特异性高③适用于降解DNA检材④种属特异性好⑤操作简单，时间短⑥仪器自动完成⑦污染⑧样本要求⑨影响因素多
复合扩增：
经过筛选的STR基因座，扩增条件基本相同，可以在同一个PCR体系中扩
增多个靶基因座，叫作复合扩增。
应用于法医的STR应满足条件：
①PCR扩增产物长度在300bp以下；
②宜选择四核苷酸STR基因组；
③选多个STR基因座应不在同一条染色体上；
④每个STR基因座
等位基因数8-10个左右；
⑤基因频率分布均匀，没有高或低频基因出现；
⑥杂合度高，
最好大于0.80;
⑦低突变率＜0.2%。
不同DNA长度分析技术比较：
不同DNA长度分析技术比较
o扩增片段长度多态性
Amp-FLP
VNTRJtSTH
单基因座探针DNAprofi1ing
多基因座採针
DMAfin.g;
erprintingDM端纹
目的DNA为STR
目百勺DMA为¥
NTR
目百令DNA为¥
0,05-10ngDNA
10-50ngDNA
500-1OOOngDNA
每人最多两条带运燮带可明显分辨
每人最多两条带这些带可明显分祈
每人显现15条以上带有些带不易分祈
0.05-1kb范围内，带分辨良好，可用于令析严重降解的D林
0.5-4kb范围内，带分辨良好.可用于分析部分降解钓DNA
4kb以上，带分辨良好降解冲直年能分祈
可分析3人以上鴻合斑
可分析3人以上混合斑
3人以上漏合斑分析困难
概率计算以群体等隹基因频率为依据
槪率计算以群体等隹基因频率为依18
概率计算不能以群徉等隹基因频率为依is*因不能确走有多少基因座
引物具有种属特异性
探针具有科属特异
採针与人和动物有广泛的交叉反虑
为保讦鉴别能力，通常多个不同基因座引物联合便用
为懈评鉴别能力通常多个不同基因座探钎联合使用
通常仅需1个或2个探针
耐热DNA聚合酶^音養参入率约为1%
杂交条件严胳，探旺与目的DNA底基配
杂交条件不严格裒探针与日的DNA错酉己率药为30-斗0%
不同DNA长度分析技术综合评价：
不同DNA长度分析技术综合评价
■
扩塔片段长度多态性
Amp^FLP
VNTR^STR
单基園座探柿
□NAprof[1in£
多基因座探针
DNAfingerprinring
UN加指统
将异性
准确性
受检材影响大
可比性
中
鉴别能力
单个检测
多个检测
技术要求
STR分型用于法医物证鉴定的主要优点：
1高灵敏度：
适用于微量降解检材。
2、
高鉴别能力：
节约检材、试剂和提高效率。
3、标准化分型：
实现数字化结果，利于实验
室间数据交换，建立数据库。
miniSTR:
通过重新设计引物，使其结合在更靠近核心重复区的侧翼序列，从而降低扩
增产物的大小，进一步提高灵敏度和分型成功率，这种技术称为短片段STR分型或miniSTR分型。
miniSTR的优势：
J.；
STR基因座的扩增片段较短，灵敏度更高，尤其适用于极微量
miniSTR分型的局限性：
1、因扩增片段长度的限制，构建复合扩增体系时只能同时扩增较少的基因座（通常每种颜色的荧光标记的基因座不超过2个）。
要想达到与传统的商品化试剂盒接近的个人识别
能力，必须增加复合扩增的次数。
2、miniSTR引物与传统的引物结合区之间若存在碱基的插入和缺失，易导致miniSTR与传统STR分型结果的不一致。
3、若某些STR基因座核心重复区上游或下游侧翼序列存在嘌呤或嘧啶碱基堆积现象，则不利于miniSTR引物设计。
4、当PCR扩增产物过小时，未消耗引物上的染料分子或称“染料污斑”（dyeblobs）可使产物峰变宽、信号变弱。
这种影响在检测降解生物样本时更为明显。
Y-STR有何法医学应用特点：
1、Y染色体为男性特有
2、Y-STR呈父系遗传特征
3、单倍体遗传：
在减数分裂过程中，Y-特异性区不发生重组，所有Y-STR基因座均
呈连锁遗传，等位基因频率不能以相乘方法计算
4、GD=PE
5、结果不具有唯一性，不能认定。
其法医学应用价值在于排除
Y-STR分型中需要注意的问题：
①因为X和Y染色体部分序列具有高度相似性，有些
Y-STR分型时在X染色体上也能检出扩增产物男性个体可见额外的产物峰，女性个体也可有分型结果。
②部分Y-STR基因座，有时可检出二个或三个等位基因，易被误
认为不同男性的混合样本。
第五章STR自动分型
STR自动分型技术的主要步骤：
1、DNA自动化提取2、PCR多色荧光标记STR
复合扩增3、PCR产物电泳前处理4、自动毛细管电泳结合激光诱导的荧光检测
5、自动数据采集并分型
off-ladder:
在STR分型图谱中，常会遇到部分样本的少量片段峰未被程序化数
字命名，在分型图谱中被标识为off-ladder。
漂移作用和新等位基因都可标识为
off-ladder
低拷贝DNA（lowcopynumber，LCN）:
是指基因组含量小于1OOpg的样本。
第六章DNA序列多态性
PCR循环测序的基本原理：
PCR技术能够快速、特异性地扩增靶DNA，应用PCR技
术测定DNA序列分为两个步骤：
先利用PCR扩增靶序列片段，制备测序模板，然后再利用PCR直接测定序列。
PCR测序采用了热循环高效合成DNA的特性并结合双脱氧核苷酸
终止法，使引物链终止的延伸产物数量在热循环过程中得到增加，因此称为循环测序。
每个
测序循环包括：
①PCR扩增制备的模板DNA变性成单链形式；
②标记引物与其中的一条链上的互补序列退火；
③退火后的引物在耐热DNA聚合酶催化下发生链延伸终止反应。
本次
循环产生的模板链与延伸终止链形成的双链的产物，在下一轮测序循环中，再次被变性，释
放出模板链，作为又一轮引发反应的模板，同时积累下一轮循环产生的链终止产物。
上述循
环步骤重复20~40次，使链终止产物以线性方式获得扩增。
DNA自动测序技术：
DNA自动测序技术是以4种荧光染料基团分别作为4种ddNTP
终止链的标记物，于20世纪80年代末期建立的一种高效、快速、自动化的序列测定技术。
4种荧光染料分别作为测序反应中4种ddNTP终止链的标记物，即4种被双脱氧核苷酸终
止的DNA片段分别带上4种不同的颜色。
这些DNA片段的混合物同时加在一个样品槽中电泳展开，相互间仅差1个碱基的DNA片段形成一条具有4种颜色的阶梯分布图像。
阶梯中的每-DNA片段由标记在该片段上的特征性荧光基团发出的荧光所指示。
荧光染料基团作为标记物的基本要求是经过激光诱发的吸收光谱波长在可见光波长范围内，不影响延伸反应，不影响标记后DNA片段的电泳性质。
其次要求4种荧光的吸收和
激发光波长要有足够的差异，便于检测。
荧光染料的掺入的方式有两种：
一种是将荧光染料
预先标记在测序反应通用引物的5'
端。
4种荧光标记形成4种标记引物，测序反应分4个
反应管进行，特定的荧光染料与相应的ddNTP是对应关系，例如荧光示踪染料JOE标记的
通用引物总是与ddATP加在同一个反应管内，因此由ddATP终止的所有延伸链都带有JOE。
这种方式被称为Dye-Primers。
另一种是将荧光染料基团连在ddNTP上，4种荧光染料分别
与4种ddNTP底物连接，反应产生的4组DNA片段分别由特定ddNTP所终止，并且标记有4种不同的荧光发色基团，A、C、G和T分别携带有绿、红、蓝、黄4种荧光。
这种方
式被称为Dye-Terminators。
两种方式各有特点，不过前者要求A，G,C,T分4个反应进
行，而后者的4组反应可以在同一管中完成。
上述两种方法都能确定4种荧光与4种ddNTP
所终止的DNA片段之间的对应关系，这是后来从电泳中检测标记物信号以及最终读序的基础。
自动测序仪器无论是变性PAG平板凝胶电泳还是毛细管电泳，都配置有激光束激发系
统和荧光信号收集检测系统。
当DNA片段电泳通过检测窗口时，在激光束的激发下，片段
的电泳时间和被激发荧光的波长、强度等信号都被记录，由计算机自动作数据处理，最后在
屏幕上显示每一样品的各终止片段电泳分离的模拟图像。
不同颜色的峰标示各自标记的碱基
及其排列顺序（如图所示）:
旳一际记四个
泳道或毛细管
惊绘数据分靳站宋
MVP（minisatellitevariantrepeat）序列：
称为具有变异核心序列的小卫星DNA，是
一类既有长度多态性又有序列差异的DNA重复序列。
线粒体DNA的特点：
①人类线粒体的基因排列得非常紧凑，除与mtDNA复制及转录
有关的一小段区域外，无内含子序列。
②mtDNA为高效利用DNA有5个阅读框架，缺少
终止密码子，仅以U或UA结尾。
③mtDNA的突变率高于核中DNA，并且缺乏修复能力。
④mtDNA为母系遗传。
⑤部分mtDNA的密码子不同于核内DNA的密码子。
血型（bloodgroup）:
是人类血液由遗传控制的个体性状之一，是血液的遗传标记（genetic
marker）。
红细胞血型是指红细胞表面抗原由遗传决定的个体差异。
化学结构
抗原分布
红细胞膜上
分泌液中
血浆中
糖脂质
HAB、PI
Lea、Leb
莫内蛋白
Rh、Kell
糖蛋白（寡糖+多肽）
MN、HLA
HAB、Lea、Leb
蛋白质
Gm、Km
ABO血型（重点）：
ABO血型系统是最早发现，最重要的血型系统。
人类学与遗传学研究、器官移植，以及法医学实践中的个人识别与亲子鉴定均需应用这个系统。
一、ABO血型.4种普通血型的划分及存在相应的抗体
1.红细胞ABO血型系统的分型。
ABO血型系统分四种型：
即O型、A型、B型与AB型。
.
2.四种血型个体血清中存在的相应抗体：
血清中有天然抗体，B型血清中有抗拟,A抗
体；
A型血清中有抗B抗体；
O型血清中有抗A、抗拟B及抗拟A，B等抗体；
AB型血清中没有抗体ABO血型抗体恒定地存在于正常人的血清中，可以预测其存在，故称为规
则抗体。
•
3.正常的A、B、AB、O型的检测。
利用抗A与抗B血清，以及A与B型红细胞，可以测定未知血液的ABO血型。
二、ABO血型抗体.
正常情况下，凡红细胞没有某一种或某两种ABO抗原，又无明显的外来A或B抗原的
刺激，其血清中含有与红细胞上缺失抗原相对应的天然抗A、抗搀、A苻1或抗B抗体。
（一）抗A、抗B抗体的生成.
新生儿血中的IgG抗拟.A与抗拟B抗体多来自母体，故一般不对新生儿进行血型测定。
3〜6个月以内的婴儿，多数尚未产生抗拟A与抗拟B抗体；
6个月以后，抗体逐渐产生；
5〜10岁抗体效价达最高峰；
随着年龄的增长，抗体效价逐渐降
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