酿酒微生物实训指导书Word文档下载推荐.docx
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细菌、酵母菌、霉菌、放线菌及噬菌体等微生物的基本结构、形态特征、生理生化特点；
掌握微生物的营养和培养基；
掌握微生物的分离和纯化；
了解微生物的代谢和发酵；
了解微生物的遗传变异和育种；
熟悉微生物的生态、传染与免疫；
了解微生物的分类和鉴定方法。
（二）能力教学目标：
要求学生会使用微生物实验室的常用器具，能进行革兰式染色；
进行五大类酿酒微生物的分类和鉴别；
会进行特一性培养基的配制，会使用高压灭菌锅进行器具和培养基的灭菌操作等，会进行分离和纯化微生物；
微生物菌种的纯种选育及贮藏复活；
微生物的生理生化反应。
（三）职业素质目标：
1、具有热爱科学、求真务实的学风和创新意识，具备进一步学习和创业的能力。
2、具有良好职业道德的意识、艰苦奋斗的作风和爱岗敬业的精神。
3、具有较强的动手能力和顶岗能力
（四）基本要求：
在教学过程中，要求学生抓好预习、听讲、实验、复习、质疑和讨论各个环节，把理论学习与实践学习结合好，使认识不断深化。
酿酒微生物实训考核方案
酿酒微生物第二学期教学主要是校内校外实训教学为主，具有特殊性，采用单独的试卷考核不能较好考核学生的情况，特制订《酿酒微生物》第学期考核方案：
一、实训、实习成绩考核由指导教师组织进行。
按教学计划和实训指导书的要求，学生必须完成实训、实习的全部任务。
实习学生须提交实习报告等规定的资料后方可参加考核。
二、考核方案
1）考勤
2）安全行为
3）学习态度
4）理论考核和实习指导教师考核（见附表）
5）实习报告、实习总结
序号
考核项目
满分
考核标准
考核情况
得分
1
实习纪律
10
严格遵守实训实习纪律，服从辅导教师和相关人员的管理，无迟到、早退、旷工等现象，迟到一次扣3分，旷课一次扣10分，早退一次扣5分，着装不规范扣5分
2
安全教育
熟悉实验室及工厂的安全操作规程，认真落实安全教育，衣着、操作符合厂方规定，违反一次扣5分
3
实训项目考核
50
每个单项目进行考核，每个人以最终分离纯化菌种得满分，否则扣5-50分。
4
现场提问
30
对本学期涉及到的理论知识进行提问考核，回答基本正确扣1-25分，回答错误不得分。
三、实习成绩评定。
评分标准如下：
90分以上：
能很好地完成实习任务，达到实习大纲中规定的全部要求，实习报告能对实习内容进行全面、系统的总结，并能运用学过的理论对某些问题加以分析。
在考核时能比较圆满地回答问题，并有某些独到见解。
实习态度端正，实习中无违纪行为。
80-89分：
能较好地完成实习任务，达到实习大纲中规定的全部要求，实习报告能对实习内容进行比较全面、系统的总结。
考核时能比较圆满地回答问题。
70-79分：
达到实习大纲中规定的主要要求，实习报告能对实习内容进行比较全面的总结，在考核时能正确地回答主要问题，学习态度基本正确，实习中无违纪行为。
60-79分：
实习态度端正，完成了实习的主要任务，达到实习大纲中规定的基本要求，能够完成实习报告，内容基本正确，但不够完整、系统，考核中能回答主要问题。
实习中虽有一般违纪行为但能深刻认识，及时改正。
60分以下：
凡具备下列条件之一者，均以不及格论。
1、未达到实习大纲规定的基本要求，实习报告马虎潦草，或内容有明显错误：
考核时不能回答主要问题或有原则性错误；
2、未参加实习的时间超过全部实习时间三分之一以上者；
3、实习中有违纪行为，教育不改，或有严重违纪行为者。
4、实训报告中存在抄袭等严重作弊行为者。
四、实习期间因故请假（或无故缺席）时间超过全部实习时间三分之一以上者，应令其补足或重新实习。
否则，其实习成绩按不及格处理。
未补实习或补做实习仍不及格者，按学籍管理的有关规定处理。
实验1：
微生物的分离和纯化
（一）、目的要求
掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术。
（二）、基本原理
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。
（三）、器材
高氏1号琼脂培养基，肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10％酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。
（四）、操作步骤
1．稀释涂布平板法
（1）倒平板将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至55—60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10％酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每毫升培养基中含链霉素30μg。
然后分别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。
试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。
也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板。
最好是将平板放室温2—3天，或37℃培养24小时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。
（2）制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。
用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。
然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。
（3）涂布将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀释度，然后用三支1ml无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6三管土壤稀释液中各吸取0．2ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
（4）培养将高氏1号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3—5日，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2—3日。
（5）挑菌将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
2．稀释混合平板法
此法与稀释涂布平板法基本相同，无菌操作也一样，所不同的是先分别吸取0．5ml10-4、10-5、10-6稀释度的土壤悬液对号放入平皿，然后再倒入溶化后冷却到45℃左右的培养基，边倒入边摇匀，使样品中的微生物与培养基混合均匀，待冷凝成平板后，分别倒置于28℃和37℃温室中培养后，再挑取单个菌落，直至获得纯培养。
3．平板划线分离法
（1）按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称。
（2）划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-1的土壤悬液一环在平板上划线。
划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。
常用的划线方法有下列二种：
（a）用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约70°
角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。
划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。
（b）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。
划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。
（3）挑菌同稀释涂布平板法，一直到菌分纯为止。
（五）、作业
1．观察结果，写出实验报告；
2、总结分析实验中存在的失误或错误之处。
实验2：
酒糟中菌种的分离纯化
1.材料及器材
（1）酒糟
（2）牛肉膏蛋白胨培养基，孟加拉红培养基，革兰氏染色液；
载玻片，盖玻片等
2.方法与步骤
（1）取曲样稀释接种
（2）不同温度条件下培养
（3）制片置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜
3.实验作业
（1）绘图说明你所观察到的酒糟中菌形态特征
（2）比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌形态上的异同
重点步骤：
培养、感官鉴别
强调操作注意事项，特别是安全：
1、注意操作规范和操作安全：
。
2、注意操作过程中严格按照操作规程进行操作，尽量使试验成功
三、学生练习：
每个同学自培养基一份，课前完成
四、学习技能知识
1、曲中菌培养要求（15min）
2、曲菌的感官特征（10min）
3、学生训练（85min）
内容1：
培养基制作
2、曲中微生物培养
3、显微镜的使用：
观察微生物的基本结构从而判断微生物种类
要求：
1、手法正确，观察仔细，并绘制观察图示。
2、注意安全：
包括人身安全、仪器设备安全
实验3：
黄水中菌种的分离纯化
（1）黄水
（1）取黄水样稀释接种
（3）绘图说明你所观察到的黄水中菌形态特征
（4）比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌形态上的异同
3、注意操作过程中严格按照操作规程进行操作，尽量使试验成功
1、黄水菌培养要求（15min）
2、黄水的感官特征（10min）
2、黄水曲中微生物培养
教师巡回指导、检查，发现问题及时纠正
实验4：
生产环境中菌种的分离纯化
（1）生产环境中微生物
（1）取生产环境中样稀释接种
（1）绘图说明你所观察到的生产环境中菌形态特征
4、注意操作过程中严格按照操作规程进行操作，尽量使试验成功
1、生产环境中菌培养要求（15min）
2、生产环境中菌的感官特征（10min）
2、生产环境中微生物培养
实验5：
霉菌种类的鉴别
1.目的要求
掌握观察霉菌形态的基本方法，并观察其形态特征。
2.基本原理
霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，而且孢子很容易飞散，所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。
此染色液制成的霉菌标本片其特点是：
（a）细胞不变形；
（b）具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长时间；
（c）溶液本身呈蓝色，有一定染色效果。
霉菌自然生长状态下的形态，常用载玻片观察，此法是接种霉菌孢子于载玻片上的适宜培养基上，培养后用显微镜观察。
此外，为了得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态还可利用玻璃纸透析培养法进行观察。
此法是利用玻璃纸的半透膜特性及透光性，将霉菌生长在覆盖于琼脂培养基表面的玻璃纸上，然后将长菌的玻璃纸剪取一小片，贴放在载玻片上用显微镜观察。
3.材料及器材
（1）培养的霉菌
（2）乳酸石炭酸棉蓝染色液，查氏培养基平板，马铃薯培养基；
载玻片，盖玻片，解剖针等
4.方法与步骤
（1）于洁净载玻片上，滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液
（2）用解剖针从霉菌菌落的边缘处取小量带有孢子的菌丝置染色液中，再细心地将菌丝挑散开
（3）小心地盖上盖玻片，注意不要产生气泡
（4）置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜
5.实验作业
（1）绘图说明你所观察到的霉菌形态特征
实验6：
乳酸种类的鉴别
（1）培养的乳酸菌
（2）牛肉膏蛋白胨培养基，革兰氏染色液；
（1）于洁净载玻片上，滴一滴革兰氏染色液
（2）进行革兰氏染色
（3）置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜
（3）绘图说明你所观察到的乳酸菌形态特征
每个同学自培养乳酸菌一份，课前完成
1、乳酸菌培养要求（15min）
2、乳酸菌的感官特征（10min）
显微镜的使用：
观察霉菌菌丝体的基本结构从而判断霉菌种类
五、总结
结合学生操作情况，指出存在问题，进一步强调注意事项，提出台面收
拾要求，督促学生完成善后工作。
了解学生层次，听取学生意见
六、布置作业
实验7：
酵母菌种类的鉴别
（1）培养的酵母菌
（2）孟加拉红培养基，美兰染色液、碘液；
（4）于洁净载玻片上，滴一滴革兰氏碘液，镜检观察
（5）进行美兰染色
（6）置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜
（5）绘图说明你所观察到的酵母菌形态特征
（6）比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌形态上的异同
每个同学自培养酵母菌一份，课前完成
1、酵母菌培养要求（15min）
2、酵母菌的感官特征（10min）
观察酵母的基本结构从而判断酵母菌种类
实验8：
大肠杆菌种类的鉴别
（1）培养的大肠杆菌
（2）伊红美蓝培养基，革兰氏染色液；
（1）从培养基上挑取典型菌落，于洁净载玻片上，进行革兰氏染色
（2）置显微镜下先用低倍镜观察，必要时再换高倍镜
（1）绘图说明你所观察到的大肠杆菌形态特征
每个同学自培养大肠杆菌一份，课前完成
1、大肠杆菌培养要求（15min）
2、大肠杆菌的感官特征（10min）
观察大肠杆菌的基本结构从而判断大肠杆菌种类
实验9：
环境因子对微生物生长的影响
了解紫外线、化学试剂、抗生素的杀菌作用
各种外界因素如紫外线、化学试剂、抗生素对微生物的生长有抑制甚至杀灭作用。
紫外线具有杀菌能力，但穿透力不强。
许多化学试剂能使蛋白质变性、妨碍代谢中某些重要酶的活力或损毁细胞膜等。
抗生素能选择性的妨碍细菌代谢过程中某一或几个环节。
⑴菌种：
大肠杆菌、葡萄球菌
⑵培养基：
营养琼脂培养基
⑶试剂：
碘伏、过氧乙酸，、龙胆紫、84消毒液、青霉素、庆大霉素
⑷其它：
无菌“H”形黑色亮光纸片、无菌滤纸片、镊子、无菌棉签、紫外灯
⑴紫外线
①用棉签蘸取菌液致密接种于营养琼脂平板上。
②把镊子在火焰上迅速通过2－3次以杀灭其表面杂菌，镊取“H”形黑纸片贴于培养基的中央。
③打开平皿盖，至于紫外灯管下直接照射30min。
④揭去黑纸片，把纸片丢弃于消毒缸内。
盖好皿盖，28－37℃培养18－24h后观察结果。
可见到培养基上出现与黑纸片形状相同的“H”形菌苔，其余部分没有细菌生长。
⑵化学试剂
②用无菌镊子夹取4个圆形无菌滤纸片，分别浸于碘伏、过氧乙酸、龙胆紫、84消毒液内，再一一取出，分别放在已接有细菌的平板上，各纸片间距离大小大致相等。
③28－37℃培养18－24h后观察各消毒纸片周围有无抑菌圈，并比较抑菌圈大小。
⑶抗生素
①用棉签分别蘸取两种菌液接种于营养琼脂平板上，一个平板接种一种菌。
②用无菌镊子夹取2个圆形无菌滤纸片，分别浸于青霉素、庆大霉素内，再一一取出，分别放在已接有细菌的平板上，各纸片间距离大小大致相等。
③28－37℃培养18－24h后观察结果，测量抑菌圈直径。
记录抑菌圈大小
实验10：
大分子物质的水解试验
目的要求
使学生理解微生物对各种有机大分子物质的的水解能力不同，说明不同微生物有不同的酶系统。
2基本原理
微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用。
必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物吸收利用。
3材料及器材
枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌
固体油脂培养基、固体淀粉培养基、明胶培养基试管、石蕊牛奶试管、尿素琼脂试管
革兰氏染色用卢戈氏碘液等
无菌平板、无菌试管、接种环、接种针、试管架
4方法与步骤
⑴淀粉水解试验
①将固体淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。
②用记号笔在平板底部划成4部分，在平板的反面分别在4部分写上菌名。
③将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌分别在不同的部分划线接种。
④将平板倒置在37℃温箱中培养24h。
⑤观察各种细菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。
⑵油脂水解试验
①将熔化的固体油脂培养基冷却至50℃左右时，充分摇荡，使油脂均匀分布，无菌操作倒入平板，待凝。
②用记号笔在平板底部划成4部分，在平板的反面分别在4部分标上菌名。
③将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌分别划十字线接种于平板相对应部分的中心。
⑤取出平板，观察菌苔颜色。
⑶明胶水解试验
①取3支明胶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。
②用接种针分别穿刺接种枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。
③20℃培养2－5d。
④观察明胶液化情况。
⑷石蕊牛奶试验
①取2支石蕊牛奶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。
②分别接种金黄色葡萄球菌和普通变形杆菌。
③35℃培养24－48h。
④观察培养基颜色变化。
⑸尿素试验
①取2支尿素培养基斜面试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。
5实验作业
记录试验结果
“+”表示阳性，“-”表示阴性
菌名
淀粉水解试验
油脂水解试验
明胶水解试验
石蕊牛奶试验
尿素试验
枯草芽孢杆菌
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
铜绿假单胞菌
普通变形杆菌
实验1
升级会员 