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1食品5班

第6周

2食品5班7-9

2食品1班

2食品2班7-9

2食品3班7-9

2食品4班

第7周

3食品1班

4食品2班　

3食品2班

3食品5班7-9

3食品4班

3食品3班

4食品1班

第8周

4食品4班7-9

4食品3班

4食品5班

第9周

5食品3班

5食品1班5-9

5食品4班5-9

第10周

5食品2班5-9

5食品5班5-9

第11周

6食品3班

6食品1班

6食品4班

第12周

6食品2班

6食品5班

实验一蛋白质沉淀和变性实验

一、实验目的

1.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。

2.了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。

3.了解蛋白质变性与沉淀的关系。

4.了解蛋白质两性性质。

二、实验原理

在水溶液中，蛋白质分子表面形成水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶液相类似。

但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。

在一定的物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。

这种反应可分为以下两种类型：

1．可逆沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于原来的溶剂中。

这种作用称为可逆沉淀反应。

如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀，提纯蛋白质时，常利用此类反应。

2.不可逆沉淀反应

在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。

这种变性蛋白质的沉淀不能再溶解于原来溶剂中的作用称为不可逆沉淀反应。

重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷）并不析出，因此，变性蛋白质不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。

三、试剂和器材

1.试剂

（1）蛋白质溶液

取5ml鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100ml，搅拌均匀后用4—8层纱布过滤，新鲜配置。

（2）蛋白质氯化钠溶液

取20ml蛋清，加蒸馏水200ml和饱和氯化钠溶液100ml，充分搅匀后，以纱布滤去不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。

（3）蛋白质沉淀试剂

硫酸铵粉末，饱和硫酸铵溶液（150ml），3%硝酸银（280ml），0.5%乙酸铅（200ml），浓硫酸（5ml/组），5%磺基水杨酸（100ml），0.1%硫酸铜（100ml），饱和硫酸铜溶液（400ml），0.1%乙酸（500ml），10%乙酸（500ml），饱和氯化钠溶液（25ml），10%氢氧化钠溶液（500ml）。

2.器材

试管，过滤漏斗，试管架，玻璃棒，沸水浴，量筒，烧杯，试剂瓶，移液管，滤纸，洗瓶，废液缸，药匙，移液管架。

四、实验步骤

1.蛋白质的可逆沉淀反应—蛋白质的盐析作用（分级盐析）

2.蛋白质的不可逆沉淀反应

（1）重金属沉淀蛋白质

水

3-4滴0.5%乙酸铅

1ml蛋白质溶液

观察沉淀

观察沉淀是否溶解

（2）酸沉淀蛋白质

数滴5%磺基水杨酸

1）磺基水杨酸对蛋白质的沉淀作用

0.5ml蛋白质溶液

观察蛋白质沉淀

观察现象

摇动试管

10滴浓硫酸

2）浓硫酸对蛋白质的沉淀作用

6滴蛋白质溶液

观察两液界面

（3）加热沉淀蛋白质

取5支试管，编号，按下表加入有关试剂（单位/滴）。

蛋白质溶液

0.1%乙酸

10%乙酸

饱和氯化钠

10%氢氧化钠

蒸馏水

5

10

—

7

将各管混匀，观察记录各管现象后，放入沸水浴中加热10min，比较各管的沉淀情况。

五、思考题

1.蛋白质可逆沉淀与不可逆沉淀的本质区别是什么？

2.简述蛋白质的沉淀反应、变性作用和凝固作用的相互关系。

实验二氨基酸的分离和鉴定—双向层析法

1.学习双向纸层析的基本原理；

2.掌握双向纸层析法分离氨基酸混合物的方法；

纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分析的层析方法。

其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；

再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。

样品经展开后某一物质在纸层析谱上的位置常用比移值Rf来表示。

Rf值=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离

纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。

一定的物质在两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的Rf值，据此可达到分析鉴定的目的。

由于滤纸纤维可吸收20～25%的水分；

且其中6～7%以氢键形式与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；

所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶剂作流动相。

纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。

氨基酸分离一般用上行法。

上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。

双相层析谱可分辨十几种以上的样品。

层析溶剂要求：

（1）被分离物质在该溶剂系统中Rf在0.05～0.8之间，各组分之Rf值相差最好能大于0.05，以免斑点重叠。

（2）溶剂系统中任一组分与被分离物之间不能起化学反应。

（3）被分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达到平衡，这样所得斑点较圆整。

本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析，以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱，如下图所示。

图1.8种氨基酸混合物双向层析结果图

（1）测试样品：

标准氨基酸混合溶液：

亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各100mg溶于50mL0.01M盐酸中。

（2）溶剂系统：

第一相：

正丁醇∶88%甲酸∶水＝15∶3∶2（V/V）；

第二相：

正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水＝5∶1∶1∶1（V/V）。

（3）显色剂：

0.1%（W/V）茚三酮丙酮液。

层析缸25×

40cm（×

2）；

培养皿15cm（×

喷雾器；

毛细管内径0.1cm；

电吹风；

烘箱；

层析滤纸12×

12cm；

铅笔；

尺；

针线等。

1.点样

取层析滤纸一张（12×

12cm），在距纸边1.2cm处划一基线；

再将纸转90°

，距纸边1.2cm处作一线与上线垂直。

以毛细管吸取混合氨基酸溶液，点与二线交点处（如下图），点的直径控制在2mm左右，不可过大。

待样品干燥后再点一次。

滤纸上点样斑点干燥后，把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铬丝相连（或以针线缝合），但不可重叠相碰。

2.展层

在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。

将圆筒形滤纸放入，点样一段接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准。

待溶剂自下而上均匀展开，约2小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸，悬挂于室温中，用电吹风充分吹尽溶剂。

然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘，将滤纸转90°

，卷成如前圆筒状，放入盛第二相溶剂的层析缸内展开（如下图），约1小时后溶剂展开到距纸边0.5cm时取出，用电吹风吹尽溶剂使其干燥。

图2.纸层析点样和展层示意图

3.显色

用喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上，然后悬滤纸于65℃烘箱内，烘30分钟，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出。

用直尺量出各斑点中心与原点的距离以及溶剂前沿与原点的距离，求出各氨基酸的Rf值。

将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，可得知该斑点的准确成分。

1、酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？

[

2、为什么展层时要用两种溶剂系统？

实验三3.5-二硝基水杨酸法测定总糖和还原性糖的含量

1.掌握还原糖和总糖的测定原理

2.学习用比色法测定还原糖的方法

在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。

在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

1.材料

无糖藕粉和玉米淀粉

2.试剂

（1）3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：

称取6.5gDNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。

（2）葡萄糖标准溶液：

准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100ml，即含葡萄糖为2.0mg/ml。

（3）6mol/LHCl：

取250ml浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500ml。

（4）碘-碘化钾溶液：

称取5g碘，10g碘化钾溶于100ml蒸馏水中。

（5）6NNaOH：

称取120gNaOH溶于500ml蒸馏水中。

（6）0.1%酚酞指示剂。

3.器材

托盘天平；

量筒（10ml或25ml）；

大（小）试管；

白瓷板；

试管架；

移液管；

三角漏斗；

滤纸；

烧杯（400mL）；

水浴锅；

长玻璃棒；

分光光度计

1.葡萄糖标准曲线的制作

[注意]标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色

取5支15mm×

180mm试管，按下表加入2.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水。

管号

葡萄糖标准液

葡萄糖含量

OD540　

/ml

/mg

0

0.2

0.8

0.4

0.6

1.2

1.6

在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。

以1.0ml蒸馏水代替葡萄糖标准液按同样显色操作为空白调零点。

以葡萄糖含量（mg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

2.样品中还原糖的提取

准确称取1g无糖藕粉，放在大试管中，先以少量蒸馏水（约2ml）调成糊状，然后加入30ml蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。

过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。

3.样品总糖的水解及提取

准确称取0.5g玉米淀粉，放在大试管中，加入6mol/LHCl10ml，蒸馏水15ml，在沸水浴中加热0.5h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。

如已水解完全，则不呈现蓝色。

水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6NNaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100ml，过滤取滤液10ml于100ml容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。

4.样品中含糖量的测定

取7支15mm×

180mm试管，分别按下表加入试剂：

项目

空白

还原糖　

　总糖

H2O/ml

样品溶液/ml

3,5-二硝基水杨酸试剂/ml

OD值/540nm

加完试剂后，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定光吸收值。

测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖量。

5.结果处理

1.比色时为什么要设计空白管？

2.总糖提取过程中，用盐酸水解玉米淀粉后，为什么要用氢氧化钠溶液进行中和？

实验四：

1.了解凝胶柱层析的原理及应用。

2.掌握凝胶柱层析的基本操作技术。

凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。

该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。

大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。

任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。

Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：

Kav=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）

在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。

分离物分子量大，Kav值小；

反之，则Kav值增大。

通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。

该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。

但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。

测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。

本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过SephadexG－25层析后达到分离。

血红蛋白溶液（Hb）：

取抗凝血（肝素）2mL，离心弃去上层血浆。

用0.9％NaCl洗血细胞数次（颠倒混匀，离心，弃去上清液），使离心后上清液几乎无淡黄色为止。

于洗净的红细胞中加入5倍体积的蒸馏水摇匀，离心去沉淀（破碎的细胞膜等）即为Hb稀释液备用。

DNP－鱼精蛋白溶液：

取鱼精蛋白0.15g溶于10％NaHCO3溶液1.5mL中（此时该蛋白质溶液pH应在8.5～9.0左右）。

另取二硝基氟苯0.15g，溶于微热的95％乙醇3mL中，待其充分溶解后立即倾入上述蛋白质溶液中。

将此管置于沸水浴中煮沸5分钟，注意防止乙醇沸腾溢出。

冷却后加2倍体积的95％乙醇，可见黄色的DNP－鱼精蛋白沉淀。

离心（300r/m）5分钟，弃去上清液，沉淀用95％乙醇洗2次，所得沉淀用1mL蒸馏水溶解，即为DNP－鱼精蛋白溶液，备用。

0.9％NaCl；

10％NaHCO3）；

95％乙醇。

pH7.0凝酸缓冲液（20mM磷酸二氢钠：

20mM磷酸氢二钠＝31mL：

69mL）

层析柱（1′15cm）；

吸管1mL（′1）；

滴管；

搅棒试管

1.凝胶溶胀

取3克葡聚糖凝胶（SephadexG-25）干粉，浸泡于蒸馏水中充分溶胀（室温6小时），或者于沸水浴中煮沸1小时后冷却。

充分溶胀后的凝胶以倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，如此反复洗涤2～3次，最后加入等体积pH7.0磷酸缓冲液备用。

2.装柱

取直径1cm，长15cm的玻璃层析柱，垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约5-7cm高的磷酸缓冲液，调节流速1滴/10秒；

待柱中剩下约0.5cm磷酸缓冲液时，关掉恒流泵，把溶胀好的糊状凝胶一次性倒入柱中，自然沉降20分钟，在此过程中可以看到凝胶均匀地沉降到柱的底部并不断地上升。

20分钟后，用镊子小心在胶面上放置圆片滤纸，用滴管补加缓冲液（注意随时添加缓冲液，防止柱床干裂）。

同时开启恒流泵，控制一定的流速，使柱中的凝胶一直处在溶液中。

若分次装入凝胶，需用玻璃棒轻轻搅动柱床上层凝胶，以免出现界面分层。

装柱长度至少10cm。

3.平衡

用磷酸缓冲液冲洗洗脱，平衡20分钟。

注意在任何时候不要使液面低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动。

4.样品制备

取DNP－鱼精蛋白溶液3滴和Hb溶液1滴混合，即为上柱样品。

5.上样

待层析柱上缓冲液几乎全部进入凝胶时，关掉恒流泵，用滴管将上述样品沿柱内壁小心加到床表面，注意尽量不使平整的床表面搅动，然后打开恒流泵，让样品进入柱床。

待其将进入柱床时，关掉恒流泵，用滴管小心加入磷酸缓冲液至柱顶。

6.洗脱

旋紧柱顶，将进液管接入洗脱液瓶中，用缓冲液进行洗脱，控制缓冲液在约每10秒一滴的流速，观察并记录Hb和DNP－鱼精蛋白在层析柱中的位置，并解释之。

待所有有色条带完全流出柱子后，继续洗柱5min。

停止恒流泵，卸下柱子，旋下柱顶螺旋，将凝胶倒回小烧杯中并取出滤纸片。

7.注意事项

（1）根据层析柱的容积和所选用的凝胶溶胀后柱床容积，计算所需凝胶干粉的重量，用洗脱缓冲液使其充分溶胀。

（2）层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。

一般来说，细长的柱分离效果较好。

若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。

柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组份移动慢，而管壁周围的移动快。

柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。

（3）各接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。

（4）装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。

但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。

（5）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。

1.凝胶过滤法除了可以进行不同分子量蛋白质的分离，还可以进行未知蛋白质分子量的测定，简述后者的实验原理。

2.影响凝胶过滤层析实验结果的因素有哪些？

实验五：

SDS-PAGE法测定未知蛋白质的相对分子量

1.了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理；

2.掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量的方法；

聚丙烯酰胺凝胶电泳之所以能将不同的大分子化合物分开，是由于这些大分子化合物所带电荷的差异和分子大小不同之故，如果将电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，这些化合物在凝胶上的迁移率则完全取决于相对分子质量。

SDS是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，就可根据标准蛋白质的相对分子量的对数对迁移率所作的标准曲线求得未知蛋白质的相对分子质量。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）可以用圆盘电泳，也可以用垂直平板电泳，本实验用目前常用的垂直平板电泳，样品的起点一致，便于比较。

（1）分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH8.9）:

取1mol/L盐酸48mL，Tris36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。

（2）浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液PH6.7）:

取1mol/L盐酸48mL,Tris5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。

（3）30%分离胶贮液：

配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（Acr）30g及N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃保存。

（4）10%浓缩胶贮液：

称Acr10g及Bis0.5g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4℃贮存。

（5）10%SDS溶液：

SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。

（6）1%TEMED；

（7）10%过硫酸铵（AP）：

现用现配。

（8）电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:

称取Tris6.0g,甘氨酸28.8g,SDS1.0g,用无离子水溶解后定容至1L。

（9）样品溶解液：

取SDS100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度增加一倍配制）。

用来溶解标准蛋白质及待测固体。

（10）染色液：

0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454mL50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。

（11）脱色液：

75mL冰乙酸，875mL重蒸水与50mL甲醇混匀。

垂直板型电泳槽；

直流稳压电源；

50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；

烧杯；

吸量管；

常头滴管等。

1．安装夹心式垂直板电泳槽

目前，夹心式垂直板电泳槽有很多型号，虽然设置略有不同，但主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。

同学们可根据具体不同型号要求进行操作。

主要注意：

安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；

勿用手接触灌胶面的玻璃。

2．配胶

根据所测蛋白质分子量范围，选择适宜的分离胶浓度。

本实验采用SDS-PAGE不连续系统，按下表的配制分离胶和浓缩胶。

试剂名称

配制20ml不同浓度分离胶