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三、蛋白质的通性、纯化和表征
1等电点pI：
在某一pH，蛋白质净电荷为零，在等电点处，蛋白质易沉淀。
2蛋白质具有胶体性质，稳定因素：
布朗运动、电荷排斥、水化层（蛋白质分子与水分子之间形成氢键）。
丁达尔效应、布朗运动、不能通过半透膜。
例子做豆腐，加盐，破坏水化层，使胶体凝固。
3蛋白质沉淀①盐析：
高浓度中性盐破坏水化层，一般不引起变性（常用盐为中性盐，硫酸盐、铵盐代表物为硫酸铵、硫酸钠、氯化钠）②有机试剂：
可引起变性，低温操作③重金属盐：
重金属中毒使用牛奶或豆浆④生物碱或某些酸⑤加热变性：
凝固。
4问答题：
蛋白质分离纯化的一般原则：
提高纯度、保持活性①生物样品的处理：
组织或细胞破碎：
匀浆、研磨、超声处理、纤维素酶或溶菌酶、去垢剂、离心等②粗分级分离：
去除大量杂质、浓缩样品：
沉淀、超滤等③细分级分离：
层析、电泳、结晶等。
注意点：
①要保持低温②抑制蛋白酶活性。
5蛋白质分离纯化方法①透析与超滤：
透析是利用蛋白质不能通过半透膜的性质，作用：
分离大小不同的蛋白质，且可以改变溶剂成分或溶液的pH。
超滤是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，蛋白质留在膜上。
②凝胶过滤（凝胶过滤层析、排阻层析、分子筛）结果为大分子蛋白质先获得。
常使用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。
③盐溶与盐析表现为低浓度时，中性盐增加蛋白质溶解度；
高浓度时，有些蛋白质沉淀。
原理为破坏水化层，降低溶解度。
④有机试剂沉淀：
降低了介电常数、破坏水化层。
⑤电泳和等点聚焦电泳为带电的蛋白质分子，将向着与其电荷符号相反的电极移动，且其移动速度不同。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等电聚焦利用蛋白质在等电点不带电荷的性质，蛋白质在等电点聚集。
双向电泳即将等电聚焦与凝胶电泳混合。
蛋白质组（proteome）：
指在特定时间、特定环境和实验各种条件下，基因组活跃表达的所有蛋白质。
⑥离子交换层析分为两个步骤：
离子交换和洗脱。
当阴离子交换，则固定相带正电荷，当阳离子交换，则固定相带负电荷。
洗脱为改变洗脱剂的pH和盐离子强度，盐浓度越高，洗下来的蛋白质的结合能力越强。
此方法用于分离与固定相结合能力不同的蛋白质。
⑦亲和层析利用蛋白质分子与其配体的特异性识别分离，相当于抗原抗体结合。
⑧高效液相层析HPLC（高压液相层析）；
反相层析：
流动相为有机分子，纯化小分子量的蛋白质。
6蛋白质分子量的测定①凝胶过滤法②SDS-PAGE法,SDS为十二烷基硫酸钠③沉降速度法：
分子量大的沉降速度快，沉降系数s越大。
S为10^-13,沉降系数可表示为4.45S，S也可用来表示生物体分子量的相对大小。
④质谱法：
利用带电粒子在电场中的运动。
7蛋白质的含量测定与纯度测定①含量测定：
凯氏定氮法、Lowry法、紫外吸收法、染色法等②纯度鉴定：
电泳、层析等。
四、蛋白质的共价结构
1蛋白质结构的组织层次一级结构为蛋白质中氨基酸的排列顺序以及二硫键的位置二级结构为氨基酸的走向三级结构为一条多肽链的完整结构四级结构为多肽链缔合成寡聚或多聚蛋白质。
2N端为头端，C端为尾端。
蛋白质的主链主要为NCCNCC;
3肽键：
一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基通过缩水反应，脱去一个水分子，形成肽键。
4肽平面：
肽键所含的4个原子和与其相连的两个α碳原子这六个原子处于同一平面称为肽平面。
5天然存在的活性肽激素：
催产素、加压素抗生素：
放线菌素D毒素：
鹅膏蕈碱脑啡肽谷胱甘肽
6了解胰岛素由51个氨基酸残基组成；
核糖核酸酶A由124个氨基酸残基组成。
7如何测定蛋白质序列？
大的蛋白质要“化整为零”，处理成小片段测序。
Step1确定N端个数，即确定蛋白质由几条肽链组成。
Step2拆分多条肽链；
打开所有二硫键。
Step3使用蛋白酶protease将肽链切成小片段，Edman降解法Edmanprocedure测定小片段序列。
Step4使用第二种蛋白酶切割肽链，Edman降解法测定所得小片段序列。
Step5对比step3和step4的结构，得出肽链的完整序列。
Step6确定二硫键位置。
8Edman降解法——测定小片段序列，通过先分别降解每个氨基酸，然后据分子量测定每个氨基酸的种类。
（用于鉴定N-末端残基）。
9蛋白质序列数据库ProteinInformationResourceEMBLSwissProtPDB
5、蛋白质的三维结构
1蛋白质的二级结构是指某段多肽链中主链骨架在局部空间有规律的盘绕和折叠，即蛋白质分子中某段肽链主链原子的相对空间位置，不包括与其他链段的相互关系及侧链构象的内容。
2二级结构的结构单元：
①α-螺旋（α-helix）②β-折叠（β-pleatedsheet）③β-转角（β-turn）④无规卷曲（randomcoil）（4个结构单元及稳定力量）
3α-螺旋①α-helix是顺时针方向，即右手螺旋②螺旋一圈由3.6个氨基酸组成，螺距0.54nm。
③每个残基的N-H与前面隔三个残基的C=O形成氢键。
4β-折叠①β-折叠是多肽链中较为伸展的结构。
②它是由平行的两条或两条以上肽链或一
条肽链内部的两段肽链形成的。
③两段肽链可以是平行的，也可以是反平行的。
前者两条链从N端到C端是同方向，后者是反向的。
稳定因素是链间肽键的C=O与N-H形成的氢键。
5β-转角①一条肽链形成180°
回折的结构称β-转角②以四个残基（三个酰胺平面）构成为常见③第一个残基C=O与第四个残基的N-H形成氢键。
6无规卷曲:
无规律性的那部分肽链的构象称无规卷曲。
7结构模体（motif）结构模体具有特征性的氨基酸序列，并发挥特殊的功能。
8由一条多肽链组成的蛋白质，只有具有完整的三级结构才具有生物活性。
稳定三级结构的因素包括侧链R间的共价键（主要是二硫键）及R之间的非共价键（包括氢键、疏水键、离子键和范德华力）。
9结构域（domain）分子量大的蛋白质三级结构，常常由两个或数个球状或纤维状的区域组成，每个区域的结构和功能相对独立，称为domain。
10结构域与结构模体的区别：
结构域更复杂，一般不同蛋白质不可能有相同的结构域；
而结构模体可以相同。
不同的蛋白质分子中其结构域的数目不同，同一蛋白质中几个结构域可彼此相似或完全不同。
11四级结构由两条或两条以上具有独立三级结构的多肽链以非共价键连接的空间排布和接触部位的布局称蛋白质的四级结构。
12维系亚基间聚合成四级结构的力量是氢键、疏水键、离子键和范德华力。
13蛋白质的变性：
蛋白质在某些理化因素的作用下，空间结构发生改变,导致生物学功能丧失,理化性质发生改变。
变性的本质:
蛋白质空间结构的破坏或改变，即破坏非共价键，共价键不破坏，肽键与一级结构无变化。
14变性蛋白质的特征：
生物学活性丧失；
蛋白质变性后易于沉淀，但不一定沉淀（pH≠pI）；
变性蛋白质由于肽链伸展，肽键暴露，故易于被蛋白酶水解，即易于消化。
15蛋白质的复性：
蛋白质较轻程度的变性后，去除变性因素后，仍可恢复或部分恢复其原有的空间结构与功能（天然活性），称为复性。
16一级结构决定三级结构（高级结构）或蛋白质三级结构的折叠信息隐藏于一级结构中。
6、蛋白质的功能与进化
1蛋白质功能的多样性（了解）：
催化：
酶；
调节：
生理功能调控、基因表达调控；
转运：
物质运输；
贮存：
营养物质，氮源；
运动：
肌肉收缩、细胞游动；
结构成分：
提供强度与保护；
支架作用：
支架蛋白；
防御与进攻：
免疫、毒蛋白。
2氧结合蛋白：
肌红蛋白与血红蛋白；
肌红蛋白：
一条多肽链（珠蛋白）+一个血红素；
血红蛋白：
四聚体，2个α亚基，2个β亚基，同源性高，α珠蛋白141AAs，β珠蛋白146AAs。
3氧分数饱和度：
结合氧气的分子占总分子的比例。
4协同效应的定义是指一个亚基与配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体的结合能力。
促进作用则称为正协同效应，反之则称负协同效应。
5当蛋白质（酶）与它的配体（某种小分子物质）结合后，引起蛋白质（酶）的空间结构（构象）发生改变，使其适合功能的需要，这种变化称别构效应或变构效应。
（氧气是血红蛋白的别构激活剂）。
6BPG（2,3-二磷酸甘油酸）是血红蛋白的别构抑制剂。
BPG对肺部氧的结合影响不大，但促进供给组织更多的氧。
（例：
高海拔）
7Bohr效应：
pH下降（H+升高），氧结合曲线右移，促进组织中氧的释放，缓冲组织中的低pH环境。
8S形曲线的氧结合、BPG效应物的调节、别构效应和波尔效应使血红蛋白的输氧达最高效率。
9镰刀细胞贫血病：
β链第6位残基Glu突变为Val。
地中海贫血：
缺少了α或β链
9、酶引论
1酶,生物催化剂，在加速生物化学反应速度的同时自身不改变。
大部分的酶是蛋白质。
核酶（酶本质RNA），脱氧核酶（酶本质DNA）。
2（问）酶加快化学反应的机理？
酶通过降低活化能提高反应速率，化学反应不仅需要碰撞，而且必须经过一个短暂的过渡态。
碰撞理论与过渡态理论。
3酶和底物形成复合物，降低了反应的活化能量：
关键在于形成酶-底物复合体；
形成复合物，催化，释放产物。
4邻近效应：
底物分子结合到酶分子表面，彼此接近。
定向效应：
底物的反应基团之间、底物与酶的催化基团之间的正确定位取向。
诱导契合
5酶催化反应的特点：
高效（催化能力强）降低活化能，特异性（专一性）活性中心、专一性和诱导契合，可调控（受到调节）限速步骤与限速酶。
大多数连续反应链的第一步就是限速步骤，限速步骤的酶就是限速酶。
6酶的活性中心（活性位点）：
酶表面与底物结合并参与催化反应过程的部分。
酶和底物在相互结合时发生构象上的细小变化，从而促进结合，利于反应的进行。
7诱导契合如何实现？
结合能，活性中心和底物之间的弱相互作用实现了诱导契合。
8酶的分类氧化还原酶类，转移酶类，水解酶类，裂合酶类，异构酶类，连接酶类；
激酶-ase。
9酶活性（酶活力）：
催化某一反应的能力。
度量酶活性的大小使用酶活性单位（酶单位）。
酶活性单位：
规定（最适）条件下，每分钟催化1umol底物转化为产物，即为1个酶单位。
Katal：
每秒钟催化1mol产物形成需要的酶的量。
kcat：
表示单位时间内一个酶分子可以转化的底物分子个数。
比活性（力）：
每毫克蛋白质所含有的酶活性单位数（U/mg）。
体现酶纯度和酶活性，对同一种酶来说，比活越大，酶纯度越高。
10固定化酶：
将酶包裹于凝胶等高分子物质中形成的酶制剂。
保持了催化能力；
产物易分离；
连续使用，易于自动化。
11化学修饰酶：
有些酶靠化学修饰调控酶的活性。
改变酶的活性、专一性、稳定性等。
12抗体酶：
用过渡态类似物作免疫原产生催化性抗体。
10、酶动力学
1影响酶催化反应速度的因素：
底物浓度ConcentrationofSubstrate,[S]，酶的浓度ConcentrationofEnzyme,[E]，pH，温度Temperature,T，抑制剂Inhibitor，激活剂。
2底物浓度[S]对酶催化反应的影响：
米氏方程
Km是初速度等于最大速度一半时的底物浓度。
酶对底物的亲和度指标。
Vmax的意义，在高底物浓度下V0实际与[S]无关，并将达到一个最大极限，称为最大初速度。
Km越小，亲和能力越强，Km越大，亲和能力越弱。
最适底物，Km最小。
（并非所有酶均适合此方程组，符合为米氏酶，含别构效应或协同效应的蛋白质不符合米氏方程。
）——双倒数法作图，
。
3酶浓度[E]对反应初速度的影响：
当底物浓度足够大时，Vo=Vmax，反应初速度和酶的浓度成正比。
pH对酶促反应初速度的影响：
每种酶都有最适pH，此时酶的活性最高，催化反应速度最快。
温度的影响：
高温会导致酶失活，低温适合保存酶。
4抑制剂对酶促反应初速度的影响：
抑制剂分两大类：
可逆的和不可逆的；
可逆抑制中最常见的两类是竞争性抑制和反竞争性抑制。
竞争性抑制剂和底物竞争结合酶的活性中心。
结果Vmax不变，Km增加。
可以借助增加底物浓度而解除。
反竞争性抑制剂结合到酶和底物的复合物上，不直接和活性中心结合。
结果Vmax降低，Km降低。
非竞争性抑制剂在活性部位以外的地方与酶结合，结果Km不变，Vmax降低。
不可逆抑制大多为毒物。
11、酶的作用机制与活性调节
1亲电催化剂：
缺电子的原子或基团亲核催化剂：
多电子。
2酸碱催化Acid-basecatalysis:
催化过程利用了H+或OH-。
共价催化Covalentcatalysis:
催化过程中有瞬时的共价键形成，酶和底物形成共价结合的中间物。
金属离子催化Metalioncatalysis:
金属离子促进酶和底物的结合，稳定过渡态。
3胰凝乳蛋白酶的催化包括诱导契合、共价催化、酸碱催化。
4酶原：
在细胞内合成及初分泌时处于无活性状态的酶的前身物。
5酶活性的调节快速调节：
酶原与酶原激活、变构调节、共价修饰慢调节：
酶含量的调节
酶的某些部位可与特异性的代谢分子可逆性的结合，从而改变酶的构象和催化活性，这种调节称为变构调节。
酶分子上某些特殊基团在其他酶作用下，发生可逆的共价结合而被修饰，并快速改变的活性称共价修饰调节。
6同工酶：
能够催化相同的化学反应，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。
举例：
乳酸脱氢酶（LDH）
12、维生素与辅酶
1脂溶性维生素包括维生素A,D,E,K。
水溶性维生素包括维生素C和B族维生素。
2VitaminA视觉夜盲症VitaminD钙磷代谢软骨病
VitaminE抗氧化神经紊乱，贫血VitaminK凝血新生儿出血
VitaminC抗氧化剂，促进铁的吸收坏血症
B
group
辅酶形式
功能
主要缺乏症
B1,
硫胺素
焦磷酸硫胺素
（TPP）
碳水化合物代谢
脚气病
B2,
核黄素
黄素单核苷酸
（FMN），黄素腺嘌呤二核苷酸
（FAD）
能量生成代谢中的电子载体
口唇干裂
烟酸，烟碱
烟碱腺嘌呤二核苷酸
（NAD+,
NADH），NADP+,
NADPH
氧化还原反应
皮炎，糙皮症
4、如何借助大熊座找到北极星？
（P58）B6,
吡哆醛
10、由于人口迅速增长、环境污染和全球气候变暖，世界人均供水量自1970年以来开始减少，而且持续下降。
氨基酸代谢
叶酸
19、阳光、空气、水、土壤、岩石、植物、动物……构成了我们周围的环境。
我们人类也是环境中的一部分，我们都生活在一不定的环境之中。
人与自然和谐相处，共同发展，是我们共同的责任。
四氢叶酸
（FH4）
21、血液中的细胞好像运输兵，负责运输吸入的氧气和产生的二氧化碳。
一碳单位代谢
19、细胞也是生物最基本的功能单位，生物的呼吸、消化、排泄、生长、发育、繁殖、遗传等生命活动都是通过细胞进行的。
巨红细胞贫血
15、在显微镜下，我们看到了叶细胞中的叶绿体，还看到了叶表皮上的气孔。
泛酸
辅酶A
（Co
A）
9、淡水是我们人类和其他生物生存的必需品，但是地球上的淡水资源十分有限，地球上的多数地区缺水。
酰基代谢
22、光的传播速度是每秒钟30万千米，光年就是光在一年中所走过的距离，它是用来计量恒星间距离的单位。
14、在太阳周围的八颗大行星，它们是水星、金星、地球、火星、木星、土星、天王星、海王星。
H,
生物素
第一单元微小世界
转移二氧化碳
B12,
钴胺素
恶性贫血
7、糖类
1多羟基醛或酮及其缩聚物和衍生物的总称。
2功能：
能源物质、结构物质；
碳源；
生物活性物质，细胞识别和信息传递的重要参与者。
3单糖：
核糖、果糖、葡萄糖。
寡糖：
蔗糖、麦芽糖、乳糖、棉子糖。
多糖：
淀粉、糖原、纤维素、壳多糖。
4四种重要的己糖：
葡萄糖甘露糖半乳糖果糖
5淀粉有直链淀粉和支链淀粉，主要区别在于直链淀粉：
葡萄糖分子以α（1-4）糖苷键缩合而成的多糖链。
8、脂质与生物膜
1磷脂（phospholipid）分甘油醇磷脂及鞘氨醇磷脂两类，磷脂是细胞膜的重要成分。
2脂肪酸的通俗名、系统名、简写符号、结构。
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