氯化两面针碱的体内抑瘤作用及机制.docx

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氯化两面针碱的体内抑瘤作用及机制

氯化两面针碱的体内抑瘤作用及机制

【摘要】　　目的研究氯化两面针碱对S180荷瘤小鼠的的抗肿瘤作用及机制。

方法以荷瘤小鼠实体瘤瘤重为实验指标评价氯化两面针碱对S180移植性肉瘤的抑制作用，免疫组织化学方法检测肿瘤组织中的p53、Bcl-2和Bax蛋白。

结果氯化两面针碱，5和10mg·kg-1剂量对S180肉瘤生长的抑制率分别为%，%和%，p53、bcl-2蛋白的表达率明显低于对照组，bax蛋白表达率高于对照组。

结论氯化两面针碱对小鼠S180肉瘤有抑制作用，其机制可能与影响癌基因的表达有关。

【关键词】两面针氯化两面针碱抗肿瘤中药

　　Abstract：

ObjectiveToinvestigatetheanti-tumoreffectofNitidinechlorideinvivoonSarcoma180miceanditsmechanism.MethodsTheantitumoreffectofNitidinechloridewasevaluatedbytumorweight.Theexpressionsofp53、bcl-2andbaxproteinsinthetissuewerestudiedbyimmunohistochemistry.ResultsNitidinechloridesignificantlyinhibitedthegrowthoftumor,theinhibitoryrateatthedoseof，5，10mg·kg-1was%，%and%respectively.Theexpressionofp53，bcl-2proteinswasdecreasedobviouslyintheNitidinechloridegroupascomparedtocontrolgroup,andtheexpressionofbaxwasincreased.ConclusionNitidinechloridehassignificantantitumoreffectinvivo,anditsinfluenceononcogenemaybeoneofitsanti-tumormechanism.

　　Keywords：

Zanthoxylumnitidum（Roxb.）DC;Nitidinechloride;Anti-tumor;TraditionalChinesemedicine

　　氯化两面针碱是从广西特有药用植物两面针Zanthoxylumnitidum（Roxb）DC的根中分离到的具有抗肿瘤活性的生物碱，据文献［1］报道，对LEWIS肺癌、人体鼻咽癌、肝癌、慢性粒细胞白血病等均有抑制作用。

本课题组前期研究也证实［2］，氯化两面针碱在体外能显着抑制口腔鳞癌KB细胞的增殖，可导致细胞周期G2/M期阻滞，并诱导细胞凋亡。

为较系统地研究氯化两面针碱的抗肿瘤活性，本实验采用小鼠移植性肉瘤S180模型，评价氯化两面针碱的体内抗肿瘤活性，并研究氯化两面针碱对原癌基因和抑癌基因的影响，探讨其可能的作用机制，为氯化两面针碱的进一步研究及开发利用提供依据。

　　1材料与仪器1试剂和仪器

　　氯化两面针碱由广西中医药研究所分离提纯，阳性对照药环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司；BCL-2，Bax，p53兔抗小鼠多克隆抗体购自SANTACRUZBIOTECHNOLOGY公司：

即用型二步法PV6001兔二步法检测试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；超净工作台：

苏州净化设备厂；病理组织切片机、病理图像分析仪：

德国Leica公司。

2动物

　　昆明小鼠，SPF级，雌雄各半，体重g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：

SCXK2003-0003。

小鼠S180肉瘤荷瘤鼠购自广西中医药研究所，由本实验室接种保存。

　　2方法

　　小鼠S180肉瘤造模方法及检测指标

　　从S180传代小鼠腹腔抽取乳白色瘤液以生理盐水稀释，调节细胞密度为1×1010·L-1。

台朌蓝染色，镜检细胞存活率≥95%。

取待接种小鼠消毒腋下皮肤，于超净工作台上将瘤细胞悬液以每只ml接种于小鼠右侧腋窝皮下，30min内接种完毕。

接种完成小鼠于动物房饲养，自由摄食饮水。

接种24h后开始给药，分别设对照组，氯化两面针碱高、中、低剂量组，CTX组，每组10只，1次/d。

给药10d结束后，次日处死全部动物，剥离瘤块，生理盐水冲洗，滤纸吸干后称重。

计算肿瘤生长抑制率：

抑瘤率=/对照组平均瘤重×100%。

　　光镜观察

　　取各组S180小鼠的瘤体，用中性福尔马林固定，取材，常规石蜡包埋切片，HE染色。

普通光学显微镜下分别观察以下指标：

①瘤细胞生长情况；②瘤组织浸润程度；③核分裂数；④血管数目；⑤坏死程度。

　　免疫组织化学法

　　剥离的瘤组织用中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，按试剂盒说明进行染色，用PBS代替一抗做阴性对照。

结果判定：

每批染色阳性对照片应显示为阳性，阴性对照片应显示为阴性，否则整批片重染。

免疫组化染色半定量分析参考文献［3］，在每个切片上、下、左、右、中各随机选取一个400倍视野，观察、计算阳性细胞数，计算总细胞数不少于1000个。

Bax、Bcl-2阳性定位于细胞浆或细胞核；p53阳性定位于细胞核。

镜下观察各组免疫组化片进行综合评分。

　　阳性表达率：

①阳性表达率为0计0分；②阳性表达率≤25%计1分；③阳性表达率为26%～50%计2分；④阳性表达率为51%～75%计3分；⑤阳性表达率＞75%计4分。

　　表达强度：

①阳性信号强烈，呈棕褐色，小块状，计为3分；②阳性信号中等，呈棕色，粗颗粒状，计为2分；③阳性信号较弱，呈淡棕色，细颗粒状，计为1分；④无阳性信号，计为0分。

　　每个视野的染色得分为该视野各级染色强度得分与该强度阳性率得分的乘积之和，一个样本的综合得分取该样本5个视野的染色得分均值。

　　统计学处理

　　所有数据用±s表示，用SPSS　行单因素方差分析。

　　3结果

　　氯化两面针碱对小鼠移植瘤生长的抑制作用

　　实验前期各组运动活动正常，精神状态良好，食欲正常。

接种后第3天，对照组和药物治疗组荷瘤鼠腋下移植瘤肉眼可见如黄豆大小。

至第7天开始对照组小鼠瘤体生长迅速，小鼠活动减少。

实验后期，对照组出现运动少、毛发干燥、无光泽，消瘦明显。

药物治疗各组运动精神状态较前为差，毛色白、有光泽，消瘦不明显，饮食正常，瘤体生长较慢。

至实验结束时各组小鼠均无死亡。

由表1可见氯化两面针碱对小鼠移植性肉瘤S180的生长有较强的抑制作用，氯化两面针碱中、高剂量组的肿瘤重量明显降低，呈现很好的量效关系。

与对照组相比，差异有统计学意义。

其中高剂量组的肿瘤抑制率接近50%，与CTX相近，抑瘤效果较好。

表1氯化两面针碱对小鼠S180肉瘤的抑制作用

　　瘤组织病理形态学观察对照组瘤细胞生长旺盛，细胞较密集或呈大片状，核分裂数多，浸润较深，部分至脂肪、肌层，血管较丰富，坏死范围较小。

氯化两面针碱各组及阳性对照组上述各指标程度较轻，有不同程度的坏死，间质显着增多，且有大量淋巴细胞、巨噬细胞浸润。

见图1～2。

　　免疫组织化学法检测凋亡相关蛋白表达S180小鼠肉瘤组织中氯化两面针碱各组p53表达与对照组比较明显下降；氯化两面针碱组Bcl-2表达较对照组弱，而对照组中阳性表达较强，说明氯化两面针碱各组p53，Bcl-2在S180肉瘤组织中的表达有下调的趋势；氯化两面针碱各组Bax的阳性表达与对照组比较明显增强，说明氯化两面针碱可以上调S180肉瘤组织中Bax的蛋白表达。

表2免疫组织化学染色综合评分

　　4讨论

　　本实验观察不同浓度的氯化两面针碱对小鼠S180肉瘤的抑制作用，氯化两面针碱中、高剂量组的肿瘤重量明显降低，其中高剂量组的肿瘤抑制率接近50%，与CTX相近。

表明氯化两面针碱在动物体内有较强的抑瘤作用。

　　p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，也是目前肿瘤疾病中最常发生变化的基因。

研究表明，p53基因在细胞周期调控、DNA修复、合成、细胞分化、凋亡等环节起着非常重要的作用［4，5］。

p53分为野生型和突变型两种。

正常细胞中含野生型p53基因及其p53蛋白，在DNA损伤修复中有着重要的作用，是DNA损伤后进行应答和修复的分子物质，对细胞分裂和增生起负调节作用，能维持细胞的的正常生长、抑制恶性增殖、诱导细胞凋亡。

突变型p53蛋白抑癌功能丧失，通过正信号调节作用，促进细胞进入增殖周期，最终使细胞生长和分化调节失控，导致细胞持续分裂和癌变。

常规免疫组化方法检测到的是突变型p53蛋白。

　　近年来的研究表明，恶性肿瘤的发生不仅与癌基因激活和抑癌基因突变或缺失有关，还与肿瘤细胞凋亡的抑制有关。

许多基因可通过自身编码的蛋白发挥诱导或抑制凋亡的作用，其中Bcl-2家族基因便是与细胞凋亡关系比较密切的一组相关基因，Bcl-2基因能阻遏多种损伤和刺激引起的凋亡，延长细胞的生存期。

Bax是Bcl-2基因家族的一个成员，Bcl-2蛋白的活性可被Bax蛋白调节［5，6］，Bax蛋白不仅能和Bcl-2蛋白形成异源二聚体抑制凋亡，而且其自身还能形成同源二聚体诱导凋亡，因此，Bax和bcl-2二者的相对水平（即Bax/Bcl-2）影响细胞凋亡的发生，Bax/Bcl-2越高，细胞越易凋亡。

Bax蛋白过度表达时，Bax同源二聚体增多，其对诱导凋亡的刺激因素更加敏感，但Bax蛋白单独并不足以启动凋亡途径，Bax蛋白只是作为p53的下游应答蛋白，与Bcl-2，p53共同参与调节细胞凋亡［6～9］。

　　本实验应用免疫组织化学方法检测了氯化两面针碱对S180荷瘤鼠肉瘤组织中p53，Bcl-2，Bax、蛋白表达的影响。

实验显示，对照组肿瘤细胞中突变型p53，Bcl-2和Bax均有不同程度的表达，氯化两面针碱突变型p53，Bcl-2表达较对照组弱，Bax表达较强。

实验结果提示，氯化两面针碱可能通过某种机制直接或间接的抑制p53基因的突变，促使突变的p53基因发生逆转，恢复损伤的DNA修复能力，或者通过某种机制抑制突变型p53表达，从而达到抑制肿瘤的作用，并改变Bax/Bcl-2的比值，改变凋亡的凋定点，使得凋亡力量在细胞内占主导优势，从而导致细胞凋亡，但通过怎样的方式进行调节还需进一步研究。

【参考文献】

　　［1］杨仓良.毒药本草［M］.北京：

中国中医药出版社,1993:

431.

　　［2］刘华钢，王博龙，秦三海，等.氯化两面针碱体外诱导人口腔鳞癌KB细胞G2/M期阻滞及凋亡的研究［J］.时珍国医国药,2007,18（9）:

2104.

　　［3］SinicropeFA,RuanSB,ClearyKR,etal.Bcl-2andp53oncoproteinsexpressionduringcolorectalmmorigenesis［J］.CancerRes,1995,55

（2）:

237.

　　［4］EI-Aneed,Anas.Currentstrategiesincancergenetherapy［J］.EuropeanJouanalofPharmacology.2004,498（3）:

1.

　　［5］AlmudévarE,PurasA,DeMiguelC,etal.Valueoftheexpressionofp21RAS,p53,Bcl-2oncoproteinsandKi-67（MIB-1）antigenof