微生物综合实验报告Word文档下载推荐.docx
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（三）实验结果18
四实验感想
项目一食品中菌落总数的测定
、八、,
刖言
随着生活人们生活水平的提高，和社会的发展与进步食品安全问题越来越受到人们的关注，然而食品方面的问题这几年也越来越突出，食品安全问题屡见不鲜。
由前几年的“苏丹红红心鸭蛋”再到这几年的“三聚氰胺奶粉事件”和“瘦肉精事件”还有“地沟油”等等一系列的事件都不得不让人们对食品安全问题高度关注。
然而食品中微生物的菌落总数是用来判定食品被细菌污染的程度即清洁状态及其安全质量，它反映食品在生产过程中是否符合国家食品安全标准要求，以便对被检样品做出适当的食品安全评价。
然而微生物的检测主要依靠菌落总数
（colonycount）的测定，菌落总数的测定是指食品检样经过处理，在一定的条件下（样品处理、培养基成分、培养温度和时间、pH需氧条件）培养后，所得到的每单位食品（1g、1mL或1cm2）中所含细菌菌落的总数。
所以说通过这些实验让我们更好的掌握菌落总数的测定一方面要求和配置；
•掌握我国食品安全标准中微
生物检验指标及意义；
•掌握常见各类食品微生物检验采样方法；
•掌握食品微生物检验各项指标检验方法和技能；
在我们以后的日常工作和学习中更好的为人们服务。
实训一食品中菌落总数的测定
一、实验目的
1.学习并掌握GB4789.2-2010食品中菌落总数的原理和基本方法，以判别食品的质量；
2.体会食品菌落总数检验的目的和意义。
二、实验说明
菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检
样中所含细菌菌落总数。
菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以
应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行食品安全与质量评价时提供依据。
三、实验器材
1•培养基:
平板计数琼脂培养基，磷酸盐缓冲液，无菌生理盐水。
2•仪器用具：
恒温培养箱（36C）、恒温水浴锅、酒精灯、试管架、无菌培养皿、无菌移液管（10mL和1m）无菌不锈钢勺、酒精灯。
四、操作步骤
图9-1食品中菌落总数的测定
1•取样、稀释
（1）以无菌操作，取检样25g（或25mL）剪碎放于含有225mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的灭菌玻璃瓶（瓶预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵，经充分振摇或研磨制成1:
10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000〜10000r/min的速度处理1min,制成1:
（2）用1mL灭菌吸管吸取1:
10稀释液1mL,沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液的试管，振摇试管混合均匀，制成1:
100的稀释液。
（3）另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此再递增稀释一次。
（4）根据对样品污染情况的估计选择2〜3个适宜稀释度，分别在制作10
倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿作空白
对照。
（5）及时将15〜20mL冷却至46C的平板计数琼脂培养基（可放置于46±
1C恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
2•培养
（1）待琼脂凝固后，翻转平板，置36±
1C温箱培养48土2h，水产品30±
1C培养72±
3h。
（2）如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固
后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4mQ,凝固后翻转平板，按上述条件
进行培养。
3.菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。
菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，cfu）表示。
3•菌落计数
（1）选取菌落数在30〜300cfu之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。
低于30cfu的平板记录具体菌落数，大于300cfu的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
（2）其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌
落生长的平板作为该稀释度的菌落数；
若片状菌落不到平板的一半，而其余一半
中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。
（3）当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
4•菌落总数的计算方法
（1）若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数围，计算两个平板菌落
数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL样品中菌落总数结
果。
（2）若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数围时，按以下公式计算:
式中：
N——样品中菌落数
工C平板（含适宜围菌落数的平板）菌落数之和;
n1――第一稀释度（低稀释倍数）平板个数;
n2――第二稀释度（高稀释倍数）平板个数;
d――稀释因子（第一稀释度）。
示例：
稀释度
菌落数（cfu）
1:
100（第一稀释度）
1000（第二稀释
度）
232,244
33,35
上述数据修约后，表示为25000或2.5X104。
（3）若所有稀释度的平板上菌落数均大于300cfu，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
（4）若所有稀释度的平板菌落数均小于30cfu，贝U应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
（5）若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1.学习帮手.
乘以最低稀释倍数计算。
（6）若所有稀释度的平板菌落数均不在30〜300cfu之间，其中一部分小于30cfu或大于300cfu时，则以最接近30cfu或300cfu的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
5•菌落总数的报告
（1）菌落数小于100cfu时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
（2）菌落数大于或等于100cfu时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数；
也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
（3）若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
（4）若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。
（5）称重取样以cfu/g
为单位报告，体积取样以
cfu/mL为单位报告
五、实验结果示例
1000（第二稀释度）
菌落数（cfu）232,244
国标中的菌落总数
1、膨化食品的落菌总数标准依据国家强制性标准GB17401-2003《膨化食品
卫生标准》规定，膨化食品的菌落总数应为w10000cfu/g、大肠菌群应为w
90MPN/100g超过国家标准规定可判断为不合格膨化食品。
2、固体饮料的落菌总数标准依据国家强制性标准GB7101-2003《固体饮料
卫生标准》规定，固体饮料产品的菌落总数应w1000cfu/g;
大肠菌群应w
90MPN/100g霉菌应w50cfu/g，超过国家标准规定可判断为不合格固体饮料。
3、糕点、面包、月饼的落菌总数标准糕点、面包、依据国家强制性标准GB7099-2003《糕点、面包卫生标准》规定，月饼产品中菌落总数不得超过1500cfu/g，大肠菌群不得超过30MPN/100g,霉菌计数不得超过100cfu/g;
蛋糕生产的标准要求：
菌落总数w10000cfu/g，大肠菌群w300MPN/100g霉菌w150cfu/g，超过国家标准规定可判断为不合格糕点类产品。
4、食醋的落菌总数标准依据国家强制性标准GB2719-200《〈食醋卫生标准》规定，食醋中菌落总数不得超过10000cfu/mL，超过国家标准规定可判断为不合格食醋。
5、冷冻饮品的落菌总数标准依据国家强制性标准GB2759.1-2003《冷冻饮品卫生标准》规定，含淀粉或果类的冷冻饮品菌落总数应w3000cfu/g,大肠菌群应w100MPN/100g含乳蛋的冷冻饮品的菌落总数应w25000cfu/g,大肠菌群应w450MPN/100g,超过国家标准规定可判断为不合格雪糕或冷饮。
6、饼干的落菌总数标准依据国家强制性标准GB7100-200《饼干卫生标准》规定，非夹心饼干的菌落总数不得超过750cfu/g，夹心饼干菌落总数不得超过2000cfu/g;
饼干产品的霉菌计数不得超过50cfu/g，超过国家标准规定可判断为不合格饼干。
7、巴氏杀菌、灭菌乳的落菌总数标准巴氏杀菌、依据国家强制性标准GB19645-2005《巴氏杀菌、灭菌乳卫生标准》规定，灭菌乳菌落总数不得超过10cfu/g，大肠菌群不得超过3MPN/100g,超过国家标准规定可判断为不合格乳制品。
8、蜜饯的落菌总数标准依据国家强制性标准GB14884-2003《蜜饯卫生标
准》规定，蜜饯食品中菌落总数不得超过1000cfu/g;
霉菌不得超过50cfu/g，超过国家标准规定可判断为不合格乳蜜饯产品。
9、调味品的落菌总数标准调味品的落菌总数标准依据SB/T10371-2003《鸡精调味料》标准规定，鸡精调味料中大肠菌群不得超过90MPNT100g,超过
国家标准规定可判断为不合格鸡精产品。
10、瓶装水的落菌总数标准依据国家强制性标准GB17324-2003《瓶装饮用
纯净水卫生标准》规定，饮用纯净水的菌落总数应w20cfu/ml，大肠菌群w
3MPN/100mJ强制性国家标准GB19298-2003《瓶（桶）装饮用水卫生标准》规定，饮用水的菌落总数应w50cfu/ml，大肠菌群应w3MPN/100mJ强制性国家标准GB8537-199《〈饮用天然矿泉水》规定，天然矿泉水的菌落总数为＜50cfu/ml，大肠菌群为0。
若超过国家标准规定可判断为不合格纯净水或矿泉水。
11、酱腌菜的落菌总数标准依据国家强制性标准GB2714-2003《酱腌菜卫
生标准》规定，酱腌菜产品的大肠菌群不得超过30MPN/100g,若超过国家标准
规定可判断为不合格酱腌12、食糖的落菌总数标准依据国家强制性标准
GB13104-2005《食糖卫生标准》规定，白砂糖、绵白糖的菌落总数不得超过100cfu/g，超过国家标准规定可判断为不合格糖制品。
13、肉干、肉铺的落菌总数标准肉干、依据强制性国家标准GB2726-2005
《熟肉制品卫生标准》规定，肉制品中大肠菌群不得超过30MPN/100g,超过国
家标准规定可判断为不合格肉制品。
14、油炸小食品的落菌总数标准依据国家强制性标准GB16565-2003《油炸小食品卫生标准》规定，油炸类炒货大肠菌群为w30MPN/100g超过国家标准规定可判断为不合格炒货制品。
15、果、蔬汁饮料的落菌总数标准15、依据国家强制性标准GB19297-2003《果、蔬汁饮料卫生标准》规定，果（蔬）汁及果（蔬）汁饮料产品的菌落总数不得
超过100cfu/mL，酵母不得超过20cfu/mL，超过国家标准规定可判断为不合格果、蔬汁饮料。
16、果冻的落菌总数标准依据国家强制性标准GB19299-2003《果冻卫生标准》规定，果冻中菌落总数w100cfu/g、大肠菌群W30MPN/100g,超过国家标准规定可判断为不合格果冻产品。
17、黄酒的菌落总数标准依据国家强制性标准GB2758-2005《发酵酒卫生标准》规定，黄酒产品的菌落总数应w50cfu/ml,超过国家标准规定可判断为不合格黄酒。
18、芝麻酱的菌落总数标准依据国家标准规定芝麻酱产品的大肠菌群应w90个/100g，超过国家标准规定可判断为不合格芝麻酱。
19、碳酸饮料的菌落总数标准依据国家强制性标准GB2759.2-2003《碳酸
饮料卫生标准》规定，碳酸饮料产品的酵母应w10cfu/mL，菌落总数应w
100cfu/mL,大肠菌群应w6MPN/100mL超过国家标准规定可判断为不合格碳酸饮料。
20、熟肉制品的菌落总数标准强制性国家标准GB2726-2005《熟肉制品卫生标准》规定，菌落总数标准限量值为w30000cfu/g，超过国家标准规定可判断为不合格熟肉制品。
21、豆制品及面筋的菌落总数标准依据国家强制性标准GB2711-2003《非发酵性豆制品及面筋卫生标准》规定，定型包装非发酵豆制品的菌落总数为w750cfu/g;
依据国家强制性标准GB2712-2003《发酵性豆制品卫生标准》规定，定型包装发酵性豆制品的大肠菌群为w30MPN/100g若超过国家标准规定可判断为不合格豆制品或面筋。
22、方便面的菌落总数标准依据国家强制性标准GB17400-2003《方便面卫生标准》规定，方便面的面块+调料菌落总数为w50000cfu/g，大肠菌群为w150MPN/100g超过国家标准规定可判断为不合格方便面。
实训二
食品中大肠菌群的测定
1.学习和掌握GB4789.3-2010食品中大肠菌群的检测原理和方法，以判别食品的安全与质量优劣；
2.体会大肠均群在食品安全与质量检验中的意义。
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的，经37r24〜48h培养能产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，同时可以推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
1.仪器和材料
恒温培养箱（36C）、恒温水浴（46C）、冰箱（2〜5C）、天平、显微镜、温度计、500mL无菌锥形瓶1个（装225mL无菌水和适量玻璃珠）、无菌培养皿
（90mm10套、1mL无菌吸管10支、10mL无菌吸管10支、50mL试管10支、无菌生理盐水200mL火柴、载玻片、接种针、试管架、杜氏管10支。
图放好倒置杜氏管的试管
2.培养基及试剂
月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂
（VioletRedBileAgar,VRBA、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水、无菌1mol/LNaOH无菌1mol/LHCI、9mL乳糖胆盐发酵管12支、乳糖发酵管12支、伊红美蓝琼脂培养基（EMB150mL革兰氏染色液1套。
四、操作步骤
方法1:
大肠菌群LST肉汤培养基MPh计数法
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图食品中大肠菌群MP时数法检验程序
1•采样及稀释
（1）固体和半固体样品：
称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生
理盐水的无菌均质杯，8000r/min〜10000r/min均质1min〜2min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min〜
2min,制成1:
10的样品匀液。
（2）液体样品：
以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:
10的样品匀液。
（3）样品匀液的pH值应在6.5〜7.5之间，必要时分别用1mol/LNaOH或
1mol/LHCI调节。
（4）用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL沿管壁缓缓注入9mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:
100的样品匀液。
（5）根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
2.乳糖初发酵试验
每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL则用双料LST肉汤），36±
「C培养24±
2h，观察倒管是否有气泡产生，24±
2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48土2h,产气
者进行复发酵试验。
未产气者为大肠菌群阴性。
3.复发酵试验
用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB管中，36±
1C培养48±
2h，观察产气情况。
产气者，为大肠菌群阳性管。
4.大肠菌群最可能数（MPN的报告
根据大肠菌群LST阳性管数，检索MPNft（如表9-1所示），报告每g（ml）样品中大肠菌群的MPN值。
表9-1大肠菌群最可能数（MPN检索表
阳性管数
MPN
95%置信区间
0.1
0.01
0.001
下限
上限
<
3.0
--
9.5
2
21
4.5
42
0.15
9.6
28
8.7
94
11
35
6.1
1.2
18
3
29
6.2
36
9.4
3.6
38
23
4.6
7.2
1.3
64
17
180
43
9
7.4
20
75
200
120
37
420
160
40
15
93
16
150
9.2
1.4
210
430
14
290
90
1000
240
3.7
460
2000
1100
4100
27
>
注1.本表采用3个稀释度［0.1g（mL）、0.01g（mL）和0.001g（mL）］、每个稀释度
接种3管。
2.表所列检样量如改用Ig（mL）、0.1g（mL）和0.01g（mL）时，表数字应相应降低
10倍；
如改用0.01g（mL）、0.001g（mL）、0.0001g（mL）时，则表数字应相应增高10倍，其余类推。
方法2:
大肠菌群平板计数法
1.大肠菌群平板计数法检验程序
检样
25gCmL）样品稀释液’均质
1。
倍系列稱释
选择2〜：
］个适宜稀释度的样品匀瀛接种VRBA平板站~3E1M4H
36±
ir
13—24h
V
计数典型和可遜菌落|
肉$
1*C
I8~24h
图大肠菌群平板计数法的检验程序
2.操作步骤
（1）样品的稀释。
同大肠菌群MPh计数法。
（2）平板计数
a.选取2〜3个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1mL同时取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
b.及时将15〜20mL冷至46C的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3〜4mLVRBA覆盖平板表层。
翻转平板，置于36±
1C培养18〜24h。
（3）平板菌落数的选择
选取菌落数在15〜150cfu之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
（4）证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管，36±
1C培养24〜48h,观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
3.大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以（3）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL样品中大肠菌群数。
例：
10-4样品稀释液1mL在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：
100X6/10X104/g（mL=6.0X105cfu/g（mL。
方法3:
生活饮用水中大肠菌群乳糖胆盐培养基MPN计数法
引自GB/T5750.12-2006《生活饮用水标准检验法》中大肠菌群的检验，为我国大多数卫生单位和水厂所使用，食品企业检验所用水一般也采用此法。
它包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
1.方法与步骤
（1）采样：
取100mL磨口带塞玻璃瓶，包扎后，干热灭菌备用。
取自来水样时，至少应先放水5min,以冲去龙头口所带的微生物，获得主流管中有代表性的水样。
取样时，用右手握瓶，左手启开瓶塞，用覆盖瓶口的纸托住瓶塞，收集样品后，连同覆盖纸一起将瓶口塞好，并用线绳在原处扎好。
注意手指不得触及瓶口部。
在静水中取样时，先用右手
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