枯草芽孢杆菌的发酵Word格式文档下载.docx
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菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。
枯草芽探杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。
枯草芽總杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。
枯草芽孑包杆菌菌体自身合成炉淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素El、E2、E6、烟酸等多种E族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性,在饲料中应用广泛。
它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。
和其它微生物混合使用，还可以用于生物肥料和土地改良等
关键词：
枯草芽孑包杆菌生长发醉活菌数
第一章材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种
枯草芽鞄杆菌
1.1.2培养基
（1）LB培养基:
蛋白脓1（）若，酵母膏5引NaCllOg,蒸憎水1000ml,pH为7,（可溶性淀粉2（也）琼脂2（）若。
（2）
筛选用培养基：
含有2%可溶性淀粉的LE培养基。
1丄3主要试剂
蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白腺、牛肉膏、尿素、氧化钱、硫酸猛、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氧化钠和氢化钙。
1.1.4仪器设备
控温摇床、高压蒸气灭菌锅、电于天平、pH测定仪、无菌操作台和紫外分光光度计。
1.2方法
1.2.1培养基的制备
⑴称量
按培养基配比依次准确地称取酵母膏、NaCK蛋白腺放入烧杯中，并在烧杯中加入少量蒸憾水。
注：
酵母膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，醉母膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
⑵溶化
可溶性淀粉溶液的配制方法：
将所需克数的可溶性淀粉放入一个小烧杯中，加入少量蒸他水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均匀倒入少于培养基总体积的沸水中，一边搅拌一边加热，待其溶化成透明状后继续在电炉上加热5分即制成可溶性淀粉溶液。
如杲配制固体培养基时，将已准备好的可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，补水到所需的总体积。
在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按2%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。
在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢岀容器。
同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。
配制培养基时，不能用铜或铁锅加热溶化，以免离于进入培养基中，影响细菌生长。
⑶调pH
培养基配好以后，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH,如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加Imol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH,直到pH达7为止；
反之，用lmol/LHCl进行调节。
对于有些要求pH较精细的微生物，其pH的调节可用酸度计迸行。
注意：
pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离于的浓度，配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固，因此应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌,再调整pH。
（4）分装
按照实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角瓶中。
液体分装：
分装的高度以试管高度的1/4左右为宜；
分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶的一半为宜。
固体分装：
分装于试管中的应不超过试管的1/5,灭菌后制成斜面；
分装三角瓶的量以不超过一半为宜。
⑸加塞
培养基分装完毕后，在试管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。
（6）包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，外边再用一道麻绳扎好。
用记号笔注明培养基名称，组别，配制日期。
三角瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结扎好，使用时容易解开，同样注明。
⑺灭菌
将配置好且包扎完毕的固体、液体培养基及本实验涉及的试管、三角瓶等&
400ml纯水于高压灭菌器中以0.14Mpa,121°
C条件下高压蒸汽灭菌2（）分钟。
（8）斜面搁置
将培养基冷却至5（）°
C左右时放置斜面，斜面在试管的1/2处为宜，待斜面凝固后，放置于冰箱中待用。
1.2.2菌种的筛选与保藏
⑴倒平板
将实验配制好的培养基加热溶化，待冷却至55—60°
C时，倒平板9皿。
⑵稀释
用接种环取菌种，放入盛9（）曲无菌水的三角瓶中，振摇。
用一支lml无菌吸管吸取lml菌液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9凶无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成1（）已、1（）日、1（）日、1（鬥、1（鬥、1（）□不同稀釋度的菌液。
⑶划线
将平板底面分别用记号笔写上100、1（&
1（門三种稀释度（共三组）然后用接种环分别沾取浓度为100、1（）日、1（門稀释液并对号在相应平板上划线，室温下静止5-10min，使菌液吸附进培养基。
（4）培养
观察淀粉圈。
对有淀
的比值，可迸行拍照,
将培养基平板倒置于37°
C的培养箱中，培养2-3°
；
粉圈的菌落，测量淀粉圈的直径D,菌落直径回，计算#选择淀粉圈较大的菌落作为后续实验的菌种。
U⑸接种
接种到斜面培养基中，标注上日期等信息。
放入恒温培养箱中培养作为一级
种于。
（6）保藏
斜面置于37°
C的培养箱中，培养2—3天，观察菌种长势好坏，若菌种长势好则将其放入冰箱中保藏，若长势不好则需多次斜面转接。
123枯草芽泡杆菌生长曲线测定
⑴取12挪遗碍，用囲帥IK期繇掴2」3,14,15,16,17,18」9,2（）,21,22和23h。
⑵接种
用1ml无菌吸管吸取2ml枯草芽砲杆菌培养液（培养10—12h）转入盛有lOOmlLB
液的三角瓶内，混合均匀。
⑶培养
将已接种的三角瓶放置37°
C振荡培养（振荡频率为lOOr/min）分别在培养
12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22和23h时，用无菌吸管吸取lml菌液放入标有相应
时间的无菌试管中，立即放入冰箱中储存，最后一同比浊测定光密度值。
（4）比浊测定
用无菌水作空白对照，选用660nm波长进行光电比浊测定，从早取出的培养液
开始依次测定，对细胞密度大的培养液用无菌水适当稀释后，使其光密度值在
（）・1T）.65之内的生长情况。
菌体进入对数生长期即可作为二级种于液用于分批培
养发酵实验。
（测定PH值前，将待测定的培养液霄荡，使细胞均匀分布）。
124菌种摇瓶培养
PH值测定结果
培养时间（h）
1
2
3
4
6
7
8
PH值
6.5
6.7
6.9
7.1
7.3
7.0
6.8
6.4
（1）称量根据需要量计算并依此称取豆饼粉、玉米粉、ZiRhp（）[]、（NH@[4（）[]、NH[]ci放入三角瓶中，配成20（）ml溶液。
（2）加塞包装。
（3）灭菌0.14Mpa,121t,20mino
（4）接种接种前一级种于需先放在恒温培养箱活化（37°
C、12h）,冷却后接种。
（5）培养放入气浴恒温振荡器中37°
C,100r/min培养13h后，镜检，观察菌的生长情况。
菌体进入对数生长期即可作为二级种于液用于分批培养发酵实验。
1.2.5产l淀粉酶枯草芽苞杆菌分批培养发酵
（1）称量根据需要量计算并依次称量豆饼粉、玉米粉、ngRhpoR、（NH（j©
S（）[]、NhQcKCaC10xl淀粉酶，放入发酵罐中加入蒸tg水配制2.5L发酵液。
（2）灭菌（）.14Mpa,121°
C,20min。
（3）接种
（4）启动发酵罐，调节发酵系数，开始发酵。
发酵参数：
温度37°
C
转速2（X）r/min
通气量1.33Wm（0—12h）
2.67Wm（12h—发酵结束）
pH值6.5
（5）测PH值，绘制生长曲线，并进行镜检，观察菌体生长状况。
（6）发酵结束，放罐。
第二章结果与分析
2.1菌种筛选及保藏
由于实验要筛选的菌种已经很纯了，所以此次实验所提到的“筛选”，是要筛选出有活力的、生长状态良好的纯种枯草芽探杆菌。
通过加入少量的可溶性淀粉酶，可以使菌种进行选择性培养，这样筛选出来的菌株可以更好地产次一淀粉酶。
筛选出来的菌种要进行保藏，此实验的保藏方法是放在冰箱中保藏。
2.2扩大培养
此次实验采用一次扩大培养，方法是摇瓶培养。
扩大培养用的培养基与发酔培养基相似。
在气浴恒温振荡器中，发现摇瓶中变浑浊，而且表面有很多气泡，这说明菌体开始生长了。
培养特定时间后，生长出来的菌种就可以用于发醉了。
2.3发酵
发醉采用的方式是分批培养发醉，在一切做好准备后，进行无菌操作，把菌体放入发酵罐中进行发醉。
整个过程都是需要时刻进行调节的，主要的调节项目为温度、pH值，因为菌体在生长的各个阶段，溫度和pH都有所变化，而想要生产岀产品，就要控制好这两个参数。
温度控制主要通过加冷却水来进行，但要注意适量，不能太过。
pH值的控制主要通过加氨水来调节，因为随着菌体生长和产物产生，环境pH值会不断下降呈酸性，所以要不断加氨水来控制。
第三章结论
枯草芽孑包杆菌在培养过程中，由于培养条件掌握不好，常出现活菌数量低，芽總形成率低等问题。
本研究通过一系列单因素实验，确定了枯草芽电杆菌的最佳发醉条件。
通过对枯草芽狼杆菌进行筛选、扩大培养和发酵的控制，很好的了解了生物产品生产的中游部分的各个步骤，初步学习了这几部分的主要注意事项，尤其对发酵有了一个初步的认识，学会了控制发酵的相关参数。
通过测量PH值，也了解了菌体的生长趋势。
培养基优化方法多是在单因素水平试验的基础上进行正交实验设计或是在正交试验基础上应用均匀设计理论，或者采用通用旋转组合设计，均能对培养基优化取得较好的效果。
在工业化生产中，还需要对接种量、pH、温度、转速、通风比、溶氧、以尺消泡剂用量等一系列因素进行严格控制，才能保证枯草芽抱杆菌发酵活菌数达到最高、发酵效果最好、在动物饲料里的添加效杲最理想。
第四章参考文献
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