植物细胞工程复习资料Word格式.docx

植物细胞工程复习资料Word格式.docx

《植物细胞工程复习资料Word格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物细胞工程复习资料Word格式.docx（11页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

分化也可以说是相同基因型的细胞所具有的各个不同的表现型。

1）时间上的分化：

一个细胞在不同的发育阶段上可以有不同的形态结构和功能；

2）空间上的分化：

对于多细胞生物来讲，同一细胞后代，由于所处的环境不同而可以有相异的形态结构和功能。

7、极性：

指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。

8、器官发生方式：

第一种方式是先芽后根；

如小麦，芦荟、苹果。

第二种方式为先根后芽；

如枸杞、苜蓿等。

第三种方式是在愈伤组织的不同部位形成芽和根，再通过维管组织的联系形成完整植株。

如胡萝卜、石刁柏

9、器官分化的过程：

离体条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过三个生长阶段1）外植体经过诱导形成愈伤组织。

2）生长中心的形成。

当把愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下以后，首先在若干部位成丛出现类似形成层的细胞群，称之为生长中心或拟分生组织，它们是愈伤组织形成器官的部位。

3）器官原基及器官形成。

生长中心形成后，按照其已确立的极性，某些细胞开始分化形成管状细胞，进而形成微管组织，开始形成不同的器官原基，进而分化出相应的组织和器官。

10、影响器官分化的因素（了解）：

1）外植体-位置、状态及组织类型（芦荟、小麦）2）生长调节剂3）光照4）温度

11、影响离体培养细胞遗传变异的因子：

1）供体植株2）培养基及培养方式3）继代培养的次数

12、四.体细胞无性系变异的诱导

（1）物理诱变剂：

X射线、ã

射线、中子、β粒子、α粒子和紫外线等。

（2）化学诱变剂：

烷化剂、碱基类似物、移码诱变剂和某些抗生素类等。

第三章

1、细胞工程实验室它必须满足三个基本的需要，即：

实验准备，包括培养基配制，洗涤与灭菌等；

无菌操作；

控制培养。

2、灭菌方法

（1）干热灭菌：

适用于玻璃器皿和金属器械的灭菌。

操作方法：

150℃、40min或120℃、120min，如果发现芽孢杆菌，160℃、90~120min

（2）湿热灭菌：

适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉塞、纸等。

121℃维持20~30min注意点：

加足水、排尽气、气压降到0时，才能开盖

（3）过滤灭菌：

培养基的灭菌一般用高压高温处理，但如果培养基中某些成分遇到高温分解（如某些生长调节剂GA3、玉米素等），就需要过滤灭菌。

另外酶、血清等也需要过滤灭菌。

灭菌方法：

将生长调节剂或酶配成一定浓度，用注射器注入微孔滤膜虑，滤膜孔径0.22-0.45微米。

制培养基时，现将培养基高压灭菌，待降至50℃左右时，加入适量的激素，然后分装

3、几种常用消毒剂的效果比较

消毒剂使用浓度（％）消毒时间（分）效果残液去除难易

次氯酸钙105～30好易

次氯酸钠2～55～30好易

新洁尔灭10～205～30好易

氯化汞0.1～12～10最好最难

过氧化氢10～125～15较好最易

抗菌素4～50mgl-130～60较好较难

（1）实验器皿、操作表面、皮肤一般用70~75%酒精

（2）升汞为剧毒药品，一则使用时注意别溅到皮肤上，二则使用后要进行处理，不能直接导入下水道。

升汞处理方法：

升汞＋Na2S—絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）—＋FeSO4（中和过多的Na2S）

4、培养室或接种室要进行熏蒸方法：

甲醛、高锰酸钾熏蒸。

甲醛的用量通常按每立方米空间2-6毫升计算，高锰酸钾的用量是甲醛的一半。

甲醛熏蒸接种室应至少在使用前24小时进行，熏蒸后密闭保持4小时以上再进入室内工作。

对有材料的培养室，也可以采用乙二醇加热熏蒸的

5、离体培养中光周期的调节：

最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。

愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：

全暗、周期性光照、散射性光照。

依据植物种类不同做法不同，多数植物适合全暗或周期性光照。

器官发生阶段：

一般给予周期性光照比较好。

6、组织培养中湿度的影响有两个方面：

一是培养容器内的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响；

一是环境的湿度条件。

环境的相对湿度一般要求70～80%。

常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度

7、PH值：

大多在5.5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8，高温灭菌会降低PH值（约0.2-0.3个PH值），因此在配制时常提高PH值0.2-0.3单位。

8、渗透压调节物质：

培养基各种物质中，糖对培养基渗透压起决定性作用。

因此调节渗透压往往从调节糖浓度着手。

9糖类的作用：

既可作为C源，又可维持培养基的渗透压，为细胞的呼吸代谢提供底物和能量。

植物组织培养中常使用蔗糖，在某些特殊培养类型中，亦使用麦芽糖、葡萄糖、果糖、纤维二糖、甘露糖等。

10、琼脂：

作为凝固剂和支撑作用用量：

0.6%~1.0%（6-10g/L）

11、活性炭：

吸收有毒害物质用量：

0.5%

12、

（1）生长素类1）吲哚类：

IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IPA（吲哚丙酸）2）萘酸类：

NAA（萘乙酸）3）苯氧羧酸类：

2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（2,4,5-三氯苯氧乙酸）、2,4,5-TP（2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。

作用：

1、促进细胞生长和细胞分裂；

2、诱导受伤组织表面细胞恢复分裂能力；

3、形成愈伤组织，促进生根；

4、与一定量的细胞分裂素配合共同诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的诱导。

（2）细胞分裂素：

主要有激动素（6-糠基氨基嘌呤KT）、6-苄基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。

其中最常用的是6—苄基氨基嘌呤。

功能：

1、促进细胞的分裂和分化；

2、诱导芽的分化；

3、促进侧芽的萌发和生长；

4、抑制衰老

（3）赤霉素（GA3）生理作用：

1、诱导茎的细胞伸长，对矮生型植物恢复成高生型特别有效，对根无效；

2、对形成层的细胞分化有影响，往往同生长素有协同作用。

IAA/GA比值高有利于木质部的分化，比值低有利于韧皮部的分化；

3、破除种子、鳞茎、块茎休眠，使之提前萌发；

4、对生长素和细胞分裂素的活性有增效作用

（4）脱落酸（ABA）生理作用：

1、抑制蛋白质的合成；

2、抵消和抑制生长素、细胞分裂素、GA的作用；

3、诱导休眠、促进衰老和脱落

注：

分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的一个重要条件比例高时——产生芽,比例低时——产生根，比例平衡时——产生愈伤组织。

13、A、培养基种类：

根据无机盐浓度分

（1）富盐平衡培养基优点：

无机盐浓度高，元素间的比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，在培养过程中可维持较好的稳定性；

营养丰富，在一般培养中，无需加入复杂的有机成分；

微量元素种类全，浓度高。

这类培养基是目前使用最广泛的培养基。

钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲性，养分数量及比例比较合适，广泛用于植物的器官、花药、细胞及原生质体的培养。

（2）高硝态氮培养基特点：

硝酸钾的含量高，氨态氮的含量低，含有较高的盐酸硫胺素。

硝酸钾含量高，氨态氮的含量低，含有较高的VB1。

主要适合与木本植物、十字花科植物和单子叶植物的组织和花药培养。

主要有B5、N6、SH培养基。

（3）中盐培养基（H、Nitsch、Miller、Blaydes）特点：

大量元素无机盐约为MS培养基的一半，微量元素种类减少而含量增高，维生素种类比MS多；

适合于花药培养。

（4）低盐培养基（White、WS、HE、Nitsch、HB）特点：

无机盐含量低，有机成分含量相对低，这类培养基多数被作为生根培养基使用。

多数用于生根培养基。

B、根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。

C、根据其作用不同，培养基分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。

D、根据其营养水平不同，培养基可分为基本培养基和完全培养基。

E、根据其态相不同，培养基可分为固体培养基和液体培养基。

14、生长调节物质母液配制：

浓度公式为：

M1×

V1=M2×

V2

吸收母液量（ml）＝所需植物生长调节剂浓度（mg/L）×

配制溶液的体积（ml）/母液浓度（mg/L）

生长素类应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容到一定的浓度。

细胞分裂素应先用少量95%乙醇或无水乙醇加3~4滴1mol/L的盐酸溶解，或直接用1mol/LHCl溶解，再用蒸馏水定容。

GA3以95%酒精溶解（不耐高温，过滤灭菌）保存在棕色试剂瓶中。

15、培养基的筛选：

无机营养成分：

一般在现有培养基配方中选择。

可以参考前人的经验，例如：

MS是广谱性培养基，N6用于单子叶植物的培养。

豆科多用B5培养基。

植物生长调节剂：

必须进行筛选试验。

总体原则-当诱导愈伤组织形成时，细胞分裂素和生长素相对平衡；

诱导芽分化时，细胞分裂素水平应高于生长素，诱导根则要低。

有机成分要根据培养类型考虑，如进行器官和组织培养，一般不加复杂有机成分，而进行细胞和原生质体培养则要加。

第四章

1、离体无性繁殖（propagationinvitro）：

利用离体培养技术，将来自优良植株的茎尖、腋芽、叶片、鳞片等器官、组织和细胞进行离体培养，在短期内获得大量遗传形状一致的个体的方法。

也称之为微繁（micropropagation）、快速繁殖（rapidcloneprogagation）。

2、离体无性繁殖程序：

（1）无菌培养物制备

（2）培养物的增殖（3）生根培养（4）炼苗和移栽（5）再生植株的鉴定

3、培养物的增殖的优缺点：

（1）腋芽增殖其特点是：

培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖。

目前采用这一方式快速繁殖的植物有石竹、马铃薯、甘薯、草莓、葡萄、月季等。

这一繁殖方式一般不需要添加外源激素，如果某些植物需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。

（2）不定芽增殖特点：

繁殖系数高，遗传稳定性较好。

但继代次数有限。

（3）胚状体增殖特点：

增长率高，双极性免去生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率仍不高。

（4）愈伤组织增殖特点：

成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。

（5）原球茎增殖特点：

4、植物脱毒（viruselimination）：

利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中浸染的病毒，生产健康的繁殖材料。

5、生根培养：

生根是获得完整植株的一个关键。

通过腋芽、不定芽、愈伤组织途径产生的芽长成试管苗，必须诱导生根才能移植。

促使试管苗生根的方法通常有两种。

一种是在固体培养基上诱导生根。

一种是浸泡的方法。

6、试管苗的特点（弱点）1、形态解剖方面

（1）根①无根毛②根与茎的输导不相连。

（2）叶①叶的角质和蜡质层不发达，容易蒸腾失水。

②无表皮毛，保水和反光能力差。

③叶细胞结构疏松。

④叶气孔突出，张大。

⑤叶存在排水孔。

2.、生理功能方面①根的生理功能：

低；

②叶片表面极易散失水分；

③气孔不能关闭；

④叶光和能力较低，CO2固定能力差

7、脱除植物病毒的方法、依据及五个假说：

（1）茎尖脱毒的依据：

病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生长点约（0.1-1mm区域），病毒浓度越稀，因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。

（2）热处理脱毒法（存在能量竞争）依据：

病毒对高温的敏感，寄主耐高温。

（3）微体嫁接离体培养脱毒法依据：

木本植物茎尖培养难以生根形成植株。

（4）珠心组织培养法依据：

柑橘类除合子胚外还有多个珠心胚，珠心组织与维管系统没有直接联系。

（5）愈伤组织脱毒依据：

植物各种器官和部位组织经诱导可产生愈伤组织，再分化培养产生芽，最后产生小植株，其中有可能得到无病毒小苗。

五个假说：

能量竞争病毒核酸和植物细胞分裂时，DNA合成均需要消耗大量的能量；

传导抑制

激素抑制

酶缺乏

抑制因子

8、指示植物：

指具有能够辨别某种病毒的专化性症状的寄主植物。

9、影响脱毒效果的因素：

1）母体材料病毒侵染的程度:

单一病毒感染的植株脱毒较容易,而复合浸染的植株脱毒较难；

2）外植体的生理状态:

顶芽的脱毒效果比侧芽好,生长旺盛的芽比休眠芽或快进入休眠的芽好；

3）起始培养的茎尖大小:

不带叶原基的生长点培养脱毒效果最好,带1-2个可获得40%脱毒苗

10、花药培养（antherculture）：

把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上,使其发育和分化成为植株的过程.

11、花粉发育的最佳时期：

单核靠边期（中晚期）

12、花粉低温预处理机制：

1）预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），进而形成愈伤组织或胚状体。

2）提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率。

3）引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。

因为低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断与小孢子之间的联系。

13、花药培养的意义（了解）：

a、缩短育种年限；

b、提高选择效率

14、花粉培养（pollenculture）:

也叫小孢子培养（microsporeculture）,是从花药中分离出花粉粒,使之成为分散的或游离的状态,通过培养使花粉粒脱分化,进而发育成完整植株的过程.

15、胚培养：

在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行离体培养的方法。

16、胚培养分类：

（1）成熟胚培养；

（2） 

幼胚培养

17、污染：

指在组培过程中培养瓶内滋生菌斑，使培养材料不能正常生长发育，从而导致培养失败的现象。

18、污染原因（从病原菌分析）：

（1）．细菌污染：

菌斑呈黏粘液状，界限比较明显，一般接种后1—2天即能发现。

主要是大肠杆菌和链球菌。

（2）．真菌污染：

菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子接种后3—10天才能发现。

主要是霉菌污染。

3、污染途径：

（1）．外植体带菌；

（2）．培养基及接种器具灭菌不彻底；

（3）．接种操作时带入；

（4）．环境不清洁

污染的预防措施：

A、 

防止外植体带菌

（1）选择好外植体采集时期和采集部位

外植体采集以春秋为宜；

优先选择地上部分作为外植体；

阴雨天勿采，晴天下午采集；

采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。

（2）室内或无菌条件下进行预培养。

（3）外植体严格灭菌灭菌效果实验多次灭菌和交替灭菌

B、保证培养基及接种器具彻底灭菌

分装时，注射器勿触瓶口。

培养基勿粘瓶口；

检查封口膜是否破损；

扎瓶口要位置适当，松紧适宜；

保证灭菌时间和高压锅内温度；

接种工具用前彻底灭菌；

工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭菌

C、操作人员严格遵守无菌操作规程

D、保证接种与培养环境清洁污

染瓶经高压灭菌后再清洗；

接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射，或用臭氧灭菌机消毒；

定期清洗或更换超净台初过滤器，进行带菌实验；

接种前15—20min打开风机，风速调整到20——30m/min，并对台面用75%酒精喷雾消毒；

定期对培养室消毒，防止高温。

20、1）外植体褐变：

指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。

2）褐变的主要原因：

①植物品种研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。

由于多酚氧化酶，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。

因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。

②生理状态由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。

一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。

一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。

③培养基成分浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。

④培养条件不当如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。

3）减轻褐变现象发生的方法：

①选择合适的外植体一般来说，最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。

②合适的培养条件无机盐成分、植物生长物质水平、适当降低培养基温度，及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。

③使用抗氧化剂

④连续转移对容易褐变的材料可间隔12~24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-l0d后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

21、玻璃化：

当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明水渍状，这种现象通常称为玻璃化。

减轻玻璃化的方法：

①增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；

②减少培养基中含氮化合物的用量；

③增加光照；

④增加容器通风，最好进行CO2施肥，这对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；

⑤降低培养温度，进行变温培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；

⑥降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。

第五章

1、单细胞分离方法：

机械法和酶解法

2、分离的最好材料：

幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。

3、悬浮培养：

指将单个游离细胞或小细胞团悬浮在液体培养基中进行培养增殖的技术。

4、细胞生长各个时期的特点：

（1）滞后期（延迟期）：

细胞很少分裂，其长短与接种量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关；

（2）对数生长期：

细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变；

（3）直线生长期：

细胞生长和发育最明显的时期；

（4）缓慢期：

生长逐渐缓慢，培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少；

（5）静止期：

生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。

5、一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：

1）悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。

2）均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。

悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。

3）细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。

6、影响悬浮细胞生长的因素：

1）起始愈伤组织的质量：

松散性好、增殖快、再生能力强。

其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。

2）接种细胞密度：

接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在0.5～2.5×

105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。

3）培养条件：

方式、温度、继代周期

7、悬浮细胞同步化：

指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。

8、单细胞培养的方法：

1、细胞平板培养；

2、看护培养；

3、微室培养；

4、饲养层培养基技术；

5、双层滤纸植板培养方法

9、植板率：

能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。

植板率（％）＝（形成的细胞团数/接种的细胞数）×

100％

10、看护培养：

用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。

第六章

1、原生质体（protoplast）：

指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。

2、原生质体分离方法：

（1）沉降法优点是纯化收集方便，操作简单，原生质体丢失少，

但是这种方法在漂洗过程中易造成原生质体的损伤，并且纯度不够好，常存在少量脱壁不完全的细胞和破碎的原生质体。

（2）漂浮法；

（3）梯度离心法

3、用于分离原生质体的材料：

无菌试管苗叶片、上胚轴和子叶、培养细胞

4、材料预处理：

用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可以提高某些材料原生质体的产量和活力。

酶解处理、酶解时间、酶解温度、酶浓度

5、影响原生质体活力的因素：

1）分离材料的生理状态；

2）酶解条件：

酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液渗透压3）分离条件：

离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间；

4）环境条件：

操作环境的温度、分离用具的影响

6、原生质体培养方法：

液体浅层培养；

固液双层培养；

固体平板培养；

琼脂糖珠培养

7、体细胞杂交：

即原生质体融合。

指将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交（A+B）。

8、体细胞杂交分类：

9、

体细胞杂交的步骤：

原生质体的制备原生质体的融合杂种细胞的选择由愈伤组织再生植株杂种植株的鉴定

10、原生质体融合的类型：

根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类：

1）对称融合（asymmetricfusion）－即两个完整的细胞原生质体融合。

2）非对称融合（symmetricfusion）－利用物理或化学方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合，

根据融合细胞的来源，原生质体分为自发融合和诱发融合

11、原生质体融合的方法及优缺点：

（1）NaNO3处理缺点：

异核体（heterokaryon）形成频率不高；

（2）高PH-高浓度钙离子处理缺点：

高的PH值是有毒的；

（3）PEG诱导融合法 

优点是融合成本低，勿需特殊设备；

融合子产生的异核率较高；

融合过程不受物种限制。

缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。

（4）电融合法优点：

1）不存在对细胞的毒害问题；

2）融合效率高；

3）融合技术操作简便。

12、影响原生质体融合的因素：

1）原生质体质量对细胞融合起着至关重要的作用，高质量的原生质体是细胞融合的首要条件；

2