进出口保健食品中育亨宾伐地那非西地那非西力士含量的测定方法Word文档下载推荐.docx
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C21H26N2O3.HCl
390.91
西地那非：
Sildenafil
139755-83-2
C22H30N6O4S
474.6
枸橼酸西地那非：
SildenafilCitrate
171599-83-0
C22H30N6O4S·
C6H8O7
666.7
伐地那非：
Vardenafilhydrochloride
224785-91-5
C23H32N6O4S.HCl
525.1
伐地那非盐酸盐：
Vardenafilhydrochloridetrihydrate
224785-90-4
C23H32N6O4S·
HCl·
3H2O
579.1
他达那非；
tadalafil
171596-29-5
C22H19N3O4
389.4
表2西地那非、伐地那非、他达拉非检测方法一览表
目标化合物
样品名称
样品前处理方法
仪器方法
参考文献
色谱柱
流动相
检测器
西地那非
保健食品
甲醇超声提取5min～30min。
DiscoveryC18（5μm250×
4.6mmI.D），流速：
0.8mL/min
40mmol/L磷酸三乙胺（pH=3.2）+甲醇+乙腈=40+30+22
二极管阵列检测器，检测波长：
291nm。
[1]
西地那非、伐地那非
人血浆
液-液-液微萃取
HypersiC18（5μm250×
0.5mL/min
150mL乙腈与350mL0.025mol/L三乙胺（以磷酸调pH=3）
UV检测器，292nm；
[2]
伐地那非
甲醇超声提取20min。
SpherigelC18（5μm250×
1mL/min
0.2%甲酸水溶液+乙腈=65+35
MS检测器：
单极质谱检测器，ESI+，m/z范围200-700
[3]
保健品
样品用甲醇超声提取
ZorbaxEclipseXDB-C18柱（5μm150×
2.0mmI.D）
乙腈和0.5%甲酸水溶液梯度洗脱，流速：
0.25mL/min
离子阱质谱检测器，在m/z100-500范围内全离子扫描并选择m/z475正离子方式。
[4]
人体血浆和尿
样品过WatersSep-PakPlusC18固相萃取小柱，用5mL10mmol/L的磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗涤后，5mL甲醇洗脱。
HP-5（15m×
0.25mmI.D.,0.25μm膜厚。
氦气，总流速50ml/min。
柱头压力110kPa，流速1.0ml/min，进样口温度325℃，进样量2μL.，程序升温
MS接口温度：
300℃；
EI方式：
70eV;
EM电压：
1800V。
SACN方式：
扫描范围35aum～550aum，扫描速度：
1.49scans/s
[5]
样品加入0.1mol/L碳酸钠缓冲液后，用乙酸乙酯提取
CapcellPakC18柱UG120，5μm150×
4.6mmI.D.
乙腈+20mmol/L磷酸钾缓冲液（pH4.5）=3+7，流速1.0mL/min。
HPLCUV检测器，292nm
[6]
精液
样品中加入三氯醋酸和0.1mol/LNaOH后，用乙酸乙酯提取。
C18柱UG120，5μm150×
4.6mmI.D.；
流速1.0mL/min。
乙腈+16mmol/L磷酸（用NaOH调pH为5.3）=32+68，
230nm。
[7]
药品
甲醇提取
SupelcosilLC-185μm250×
4mmI.D.
乙腈+磷酸钠缓冲液（pH3）=2+8，流速1.0mL/min
UV检测器，230nm
[8]
西地那非、伐地那非、他达那非
口服液、酒、饮料
用甲醇稀释
C18柱（5μm），流速1.0mL/min
20mmol/L乙酸铵和0.2%甲酸水溶液梯度洗脱。
全扫描：
m/z60-600,SIR定量
[9]
药品用流动相超声提取20min。
PhenomenexLunaC185μm150×
乙腈+水=45+55（V/V），流速1.0mL/min。
UV检测器，220nm
[10]
他达那非
样品用甲醇超声（80℃）提取
ChromolithPerformanceRP-18e（100×
4.6mmI.D）
0.1mol/L磷酸缓冲液（pH3.0）+乙腈=8+2;
流速0.5mL/min
UV检测器，230nm；
[11]
样品用水湿润后用甲醇振药提取
H和C18柱，10μm300×
3.9mmI.D.（Waters,USA）
甲醇+水+乙腈=6+2+2，用0.1%冰醋酸调pH6.1，流速0.50mL/min
UV检测器，290nm；
[12]
体液
样品加入NH4Cl缓冲液（pH9.5）后，用氯仿/2丙醇/n-heptane（25/10/65）提取。
NovaPakC18（Waters,Milford,MA）,4μm150×
2.0mmI.D.
乙腈+三乙胺和2mmol/LNH4COOH缓冲液梯度洗脱流速：
0.20mL/min
API-100单四极杆质谱分析器，阳离子方式，SIR（m/z475,283,534）
[13]
软饮料
样品用甲醇稀释
TSKgelODS80TM（5μm150×
水+乙腈=13+7，用甲酸调pH3.0，流速1.0mL/min
单极，正离子
[14]
四、术语（《中国药典2005年版》）
片剂：
系指药物与适宜的辅料压制而成的圆片状或异形片状的固体制剂，抗疲劳保健食品只要是口服普通片。
胶囊剂：
系指药物或叫加有辅料充填于空心胶囊或密封于软质囊材中的固体制剂。
抗疲劳保健食品胶囊剂主要为硬胶囊和软胶囊两类，供口服用。
硬胶囊（通常称为胶囊）：
系采用适宜的制剂技术，将药物或加适宜辅料制成粉末、颗粒、小片或小丸等充填于空心胶囊中的胶囊剂。
软胶囊：
系将一定量的液体药物直接包封，或将固体药物溶解或分散在适宜的敷形剂中制备成溶液、混悬液、乳状液或半固体，密封于球形或椭圆形的软质囊材中的胶囊剂。
可用滴制法或压制法制备。
软质囊材是由胶囊用明胶、甘油或其他适宜的药用材料单独或混合制成。
口服溶液剂（药酒与口服溶液剂一致）：
系制药物溶解于适宜溶剂中制成供口服的澄清液体制剂。
五、方法论证
1、样品制备
本标准方法的样品制备按照《中国药典2005年版附录I制剂通则》的取样量及药典相关剂型制备方法进行。
对于片剂、胶囊剂进行检测时，最大的取样量均为20片（粒），口服溶液剂最大的取样量均为10支。
片剂试样的制备方法：
随机取同一批号的供试品20片，研细（用研钵充分研成粉末状试样）。
硬胶囊试样的制备方法：
随机取同一批号的供试品20粒，倾出内容物，研细（用研钵充分研成粉末状试样）。
软胶囊试样的制备方法：
随机取同一批号的供试品20粒，将内容物全部挤到一离心管中，在混匀器上充分混匀，作为试样。
口服溶液剂试样的制备方法：
随机取同一批号的供试品10支（瓶），取等量体积样品到同一容器中混匀作为试样。
2、试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。
2.1甲醇：
液相色谱级。
2.2乙腈：
2.3乙酸：
优级纯。
2.40.1%乙酸水溶液∶甲醇混合液：
1+1（V/V）。
2.5育亨宾（yohimbin）CAS
号：
146-48-5，分子式：
C21H26N2O3）标准品纯度大于等于99.0%。
2.6他达那非（tadalafil，CAS号：
171596-29-5，分子式：
C22H19N3O4）标准品纯度大于等于99.0%。
2.7西地那非（Sildenafil，CAS号：
139755-83-2，分子式：
C22H30N6O4S）标准品：
纯度大于等于99.0%。
2.8伐地那非（vardenafil，CAS号：
224785-91-5，分子式：
HCl）标准品：
2.9标准溶液：
分别准确称取适量育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非标准品，用甲醇配制成浓度为10μg/mL的混合标准储备液（4℃下避光保存6个月）。
根据需要用0.1%乙酸∶甲醇混合液（4.4）将标准储备液稀释成1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的混合标准工作溶液（4℃下避光保存1个月）。
3仪器
3.1高效液相色谱-串联质谱仪：
配有电喷雾离子源（ESI）。
3.2超声波清洗器。
3.3旋涡混匀器。
3.4分析天平：
感量0.1mg和0.01g各一台。
3.5真空泵。
3.6离心机。
4质谱条件的确定
将仪器条件、各路气体流量调到最佳值,使仪器响应达到最佳。
API4000优化的参数为：
雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯液氮气，其参考值为：
窗帘气（CUR）：
20.00；
雾化气（GS1）：
40.00psi；
辅助加热气（GS2）：
45.00psi；
碰撞气（CAD）：
7.00psi；
离子源喷雾电压（IS）：
5000.00V；
TEM：
550.00℃；
ihe：
ON。
采用SyringePump对4种目标化合物进行质谱条件的优化（以育亨宾为例）
4.1Q1扫描寻找母离子,为355.2。
图1Q1扫描图
4.2进行DP扫描,确定DP电压为108v。
图2DP电压扫描图
4.3Q3扫描确定子离子为144.1和212.4;
进行CE扫描和MRM试验,确定两个子离子的最佳CE值为30和50,EXP值为15.
图3子离子扫描图
同样方法确定各目标化合物的质谱条件见表3.
表34种目标化合物质谱条件
Q1
m/z
Q3
m/z
DP电压
（V）
EP
CE
CXP
育亨宾
355.2*
144.1*
108
10
30
15
355.2
212.4
50
489.5*
151.1*
120
60
14
489.5
312.1
56
18
475.3*
100.1*
110
40
16
475.3
58.0
82
12
390.4*
268.3*
70
17
390.4
135.1
22
注：
“*”为定量离子对。
5、色谱柱的确定
在上述质谱条件下，选择色谱柱COSMOSIL5C18-MS-IIWaters，2.1×
150mm,5μm；
色谱柱2：
ZORBAXEclipseXDB-C18，4.6×
250mm,5μm；
流动相组成：
0.1%乙酸水溶液与乙腈梯度洗脱。
此两种色谱柱均能对该4种化合物进行分离，从实验室通用性考虑，我们采用了ZORBAXEclipseXDB-C18，4.6×
150mm,5μm。
6流动相组成的确定
由于有机相的含量对目标化合物洗脱影响较大，采用等梯度洗脱时，若有机相含量低，伐他达那非难以洗脱，提高有机相含量，不仅伐地那非、西地那非分离不佳，而且育亨宾洗脱速度太快，易产生离子抑制效应，影响定量分析，因而我们采取了梯度洗脱方式。
通过实验证明，在流动相中加入0.1%的乙酸，可以减少拖尾，优化色谱峰型。
经过实验证明，流速为500μL/min，在下列梯度洗脱条件（见表4）下，4种目标化合物均得到了很好的分离（见图4）。
表4流动相梯度洗脱程序
时间
min
0.1%乙酸水溶液
%
乙腈
0.00
80.0
20.0
3.00
8.00
5.0
95.0
13.00
13.01
20.00
图4育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非标准提取离子叠加色谱图及提取离子色谱图
5、标准曲线和线性范围
在所选择的LC/MS/MS条件下，采用选择的定量离子，4种目标化合物在1ng/mL-100ng/mL范围内成线性关系，线性方程、相关系数和线性曲线见图5-8。
图5育亨宾定量离子对（355.2/144.1）线性曲线（r=0.9997）
图6伐地那非定量离子对（486.5/151.1）线性曲线（r=0.9993）
图7西地那非定量离子对（475.3/100.1）线性曲线r=0.9997
图8他达那非定量离子对（390.4/268.3）线性曲线r=0.9996
超出线性范围后，应当对提取液进行适当的稀释，使得检测的响应在线性范围之内。
根据样品处理方法,在此浓度范围内，它们分别相当于样品含有目标化合物：
固体样品为1.0mg/kg～100.0mg/kg的含量范围,液体样品为0.010mg/L～100.0mg/L.此时固体样品的检测定量低限为1.0mg/kg，液体样品的定量低限为0.01mg/L，满足保健食品中是否添加有这4种违禁药物检验要求。
图9育亨宾检测低限1ng/mL提取离子色谱图
图10伐地那非检测低限1ng/mL提取离子色谱图
图11西地那非检测低限1ng/mL提取离子色谱图
图12他达那非检测低限1ng/mL提取离子色谱图
6、实验室内精密度实验
6.1量取待测试样1.0mL于10.0mL容量瓶中，加入0.1%乙酸l+甲醇（1+1，V/V）经充分混匀后定容，过0.45μm微孔滤膜后，上LC/MS/MS测定。
实验试样：
氨基酸饮品，该试样不含待测违禁物。
表5氨基酸饮品育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非添加实验室内精密度实验结果
添加水平（ng/mL）
伐地那非
西地那非
他达那非
测定结果（ng/mL）
变异系数
CV（%）
回收率
（%）
变异系数CV（%）
测定结果（ng/mL）
变异系数CV（%）
10.0
10.4
5.8
93.6
-112
9.77
5.7
81.1-
97.9
9.95
5.3
91.1-107
5.5
82.1-97.7
9.80
8.91
9.11
8.58
11.2
9.15
9.42
9.27
9.36
9.09
10.7
9.03
10.7
8.11
9.7
8.85
10.2
9.48
10.2
8.21
50.0
51.9
2.4
96.6-104
48.2
4.6
86.6-
99.2
45.6
4.8
91.2-103
3.9
89.8-101
50.4
49.6
51.6
50.6
48.3
43.3
49.3
51.5
47.6
50.1
48.6
44.7
45.3
50.2
50.3
45.9
44.9
100
97.5
4.4
94.4-104
95.8
4.3
85.6-
98.6
99.1
3.0
95.8-105
96.5
4.2
92.8-103
102.8
93.9
95.8
98.9
92.2
98.6
101.4
90.9
94.4
94.3
105.3
102.7
104．1
85.6
93.7
95.6
91.7
98.7
92.8
图13试剂空白提取离子叠加色谱图
图14氨基酸口服液提取离子叠加色谱
图15氨基酸口服液添加10μg/L育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
图16氨基酸口服液添加50μg/L育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
图17氨基酸口服液添加100μg/L育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图
6.2、片剂样品提取方法的选择及实验室内回收率
称取碾碎混匀的样品1.00g于100mL容量瓶中，加入80mL甲醇于超声波清洗器中超声处理30min后，取出冷却，用甲醇定容并充分混匀，定量取1.0mL提取液于10.0mL容量瓶中，用0.1%乙酸+甲醇（1+1）定容后混匀，过0.45μm微孔滤膜后，上LC/MS/MS测定。
我们选择了可邦男性抗衰老片作为添加回收实验样，经试验该试样中不含这4种违禁药物。
表6可邦男性抗衰老片中添加育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非实验室内精密度数据及回收率
伐地拉非
西地拉非
测定结果
mg/kg
变异
系数
CV
测定结果（mg/kg）
系数CV
样品
未检出
未检出
升级会员 