进出口保健食品中育亨宾伐地那非西地那非西力士含量的测定方法Word文档下载推荐.docx

1、C21H26N2O3.HCl390.91西地那非：Sildenafil 139755-83-2 C22H30N6O4S 474.6 枸橼酸西地那非：Sildenafil Citrate 171599-83-0 C22H30N6O4SC6H8 O7 666.7 伐地那非：Vardenafil hydrochloride224785-91-5C23H32N6O4S.HCl525.1伐地那非盐酸盐：Vardenafil hydrochloride trihydrate224785-90-4 C23H32N6O4SHCl 3H2O 579.1 他达那非；tadalafil 171596-29-5 C2

2、2H19N3O4 389.4 表2 西地那非、伐地那非、他达拉非检测方法一览表目标化合物样品名称样品前处理方法仪器方法参考文献色谱柱流动相检测器西地那非保健食品甲醇超声提取5 min30 min。Discovery C18（5m 2504.6 mm I.D），流速：0.8 mL/min 40 mmol/L 磷酸三乙胺（pH=3.2）+甲醇+乙腈=40+30+22 二极管阵列检测器，检测波长：291 nm。1 西地那非、伐地那非人血浆液-液-液微萃取Hypersi C18（5m 2500.5 mL/min 150 mL 乙腈与350mL 0.025 mol/L 三乙胺（以磷酸调pH=3） UV

3、检测器，292nm；2 伐地那非甲醇超声提取20min。Spherigel C18（5m 2501 mL/min 0.2%甲酸水溶液+乙腈=65+35 MS 检测器：单极质谱检测器，ESI+，m/z 范围200-700 3 保健品样品用甲醇超声提取Zorbax Eclipse XDB-C18 柱（5 m 1502.0 mm I.D） 乙腈和0.5%甲酸水溶液梯度洗脱，流速：0.25 mL/min 离子阱质谱检测器，在m/z 100-500 范围内全离子扫描并选择 m/z 475 正离子方式。4 人体血浆和尿样品过Waters Sep-Pak Plus C18 固相萃取小柱，用5 mL 10 m

4、mol/L 的磷酸钠缓冲液（pH 7.0）洗涤后，5mL 甲醇洗脱。HP-5（15 m0.25 mm I.D.,0.25 m 膜厚。氦气，总流速50ml/min 。柱头压力110kPa ，流速1.0 ml/min ， 进样口温度325，进样量2L.，程序升温MS 接口温度：300；EI 方式：70 eV;EM 电压：1800V。SACN 方式：扫描范围35 aum550 aum，扫描速度：1.49scans/s 5 样品加入0.1 mol/L 碳酸钠缓冲液后，用乙酸乙酯提取Capcell Pak C18 柱 UG120， 5 m 1504.6 mm I.D. 乙腈+20 mmol/L 磷酸钾缓

5、冲液（pH4.5） =3+7，流速1.0 mL/min。HPLC UV 检测器，292 nm 6 精液样品中加入三氯醋酸和0.1 mol/L NaOH 后，用乙酸乙酯提取。C18 柱 UG120， 5m 150 4.6 mm I.D. ；流速1.0 mL/min。乙腈+16 mmol/L 磷酸（用NaOH 调pH 为5.3）=32+68， 230 nm。7 药品甲醇提取Supelcosil LC-18 5m 2504 mm I.D. 乙腈+磷酸钠缓冲液（pH3）=2+8 ，流速1.0 mL/min UV 检测器，230 nm 8 西地那非、伐地那非、他达那非口服液、酒、饮料用甲醇稀释 C18

6、柱（5m），流速1.0 mL/min 20 mmol/L 乙酸铵和0.2%甲酸水溶液梯度洗脱。全扫描： m/z 60-600,SIR 定量9 药品用流动相超声提取20 min。Phenomenex Luna C18 5m 150 乙腈+水=45+55（V/V），流速1.0 mL/min。UV 检测器，220 nm 10 他达那非样品用甲醇超声（80）提取Chromolith Performance RP-18e （1004.6 mm I.D） 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH 3.0）+乙腈=8+2; 流速0.5 mL/min UV 检测器，230nm；11 样品用水湿润后用甲醇振药提取H

7、 和C18 柱，10m 3003.9 mm I.D. （Waters,USA） 甲醇+水+乙腈=6+2+2，用0.1%冰醋酸调pH 6.1，流速0.50 mL/min UV 检测器，290nm；12 体液样品加入NH4Cl 缓冲液（pH 9.5） 后，用氯仿/2丙醇/n-heptane（25/10/65）提取。NovaPak C18（Waters,Milford, MA）, 4m 1502.0 mm I.D. 乙腈+三乙胺和2 mmol/L NH4COOH 缓冲液梯度洗脱流速：0.20 mL/min API-100 单四极杆质谱分析器，阳离子方式，SIR （ m/z 475,283,534）

8、13 软饮料样品用甲醇稀释TSK gel ODS 80TM（5m 150 水+乙腈=13+7，用甲酸调pH 3.0，流速1.0 mL/min 单极，正离子14四、术语（中国药典 2005 年版） 片剂：系指药物与适宜的辅料压制而成的圆片状或异形片状的固体制剂，抗疲劳保健食品只要是口服普通片。胶囊剂：系指药物或叫加有辅料充填于空心胶囊或密封于软质囊材中的固体制剂。抗疲劳保健食品胶囊剂主要为硬胶囊和软胶囊两类，供口服用。硬胶囊（通常称为胶囊）：系采用适宜的制剂技术，将药物或加适宜辅料制成粉末、颗粒、小片或小丸等充填于空心胶囊中的胶囊剂。软胶囊：系将一定量的液体药物直接包封，或将固体药物溶解或分散在

9、适宜的敷形剂中制备成溶液、混悬液、乳状液或半固体，密封于球形或椭圆形的软质囊材中的胶囊剂。可用滴制法或压制法制备。软质囊材是由胶囊用明胶、甘油或其他适宜的药用材料单独或混合制成。口服溶液剂（药酒与口服溶液剂一致）：系制药物溶解于适宜溶剂中制成供口服的澄清液体制剂。五、方法论证 1、样品制备 本标准方法的样品制备按照中国药典2005 年版附录I 制剂通则的取样量及药典相关剂型制备方法进行。对于片剂、胶囊剂进行检测时，最大的取样量均为20 片（粒），口服溶液剂最大的取样量均为10 支。片剂试样的制备方法：随机取同一批号的供试品20 片，研细（用研钵充分研成粉末状试样）。硬胶囊试样的制备方法：随机取

10、同一批号的供试品20 粒，倾出内容物，研细（用研钵充分研成粉末状试样）。软胶囊试样的制备方法：随机取同一批号的供试品20 粒，将内容物全部挤到一离心管中，在混匀器上充分混匀，作为试样。口服溶液剂试样的制备方法：随机取同一批号的供试品10 支（瓶），取等量体积样品到同一容器中混匀作为试样。2、试剂和材料除另有说明外， 所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。2.1 甲醇：液相色谱级。2.2 乙腈：2.3 乙酸：优级纯。2.4 0.1 %乙酸水溶液甲醇混合液：1+1（V/V）。2.5 育亨宾 （yohimbin）CAS号：146-48-5，分子式：C21H26N2O3）标准品纯度大

11、于等于99.0%。2.6 他达那非（tadalafil，CAS号：171596-29-5，分子式：C22H19N3O4）标准品纯度大于等于99.0%。2.7 西地那非（Sildenafil，CAS号：139755-83-2，分子式：C22H30N6O4S）标准品：纯度大于等于99.0%。2.8 伐地那非（vardenafil，CAS号：224785-91-5，分子式：HCl）标准品：2.9 标准溶液：分别准确称取适量育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非标准品，用甲醇配制成浓度为10 g/mL的混合标准储备液（4下避光保存6个月）。根据需要用0.1 % 乙酸甲醇混合液（4.4）将标准储备液稀释成

12、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的混合标准工作溶液（4下避光保存1个月）。3 仪器3.1高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。3.2 超声波清洗器。3.3 旋涡混匀器。3.4 分析天平：感量 0.1 mg和 0.01 g各一台。3.5 真空泵。3.6 离心机。4 质谱条件的确定 将仪器条件、各路气体流量调到最佳值,使仪器响应达到最佳。API 4000优化的参数为： 雾化气、窗帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯液氮气，其参考值为：窗帘气（CUR）：20.00；雾化气（GS1）：40.00 psi；辅助加热气（GS2）：45.00

13、 psi；碰撞气（CAD）：7.00 psi； 离子源喷雾电压（IS）：5000.00 V；TEM：550.00；ihe：ON。采用Syringe Pump 对4 种目标化合物进行质谱条件的优化（以育亨宾为例） 4.1 Q1扫描寻找母离子,为355.2。图 1 Q1扫描图4.2 进行DP扫描,确定DP电压为108v。图2 DP电压扫描图4.3 Q3扫描确定子离子为144.1和212.4;进行CE扫描和MRM试验,确定两个子离子的最佳CE值为30和50,EXP值为15.图3 子离子扫描图同样方法确定各目标化合物的质谱条件见表3.表3 4种目标化合物质谱条件Q1m/zQ3m/z DP电压（V）EP

14、CECXP育亨宾355.2*144.1*108103015355.2212.450489.5*151.1*1206014489.5312.15618475.3*100.1*1104016475.358.08212390.4*268.3*7017390.4135.122注：“*”为定量离子对。5、色谱柱的确定在上述质谱条件下，选择色谱柱COSMOSIL 5C18-MS-II Waters，2.1 150 mm, 5 m；色谱柱2：ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 250 mm, 5 m；流动相组成：0.1%乙酸水溶液与乙腈梯度洗脱。 此两种色谱柱均能对该4种化合物进行分离，从

15、实验室通用性考虑，我们采用了ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 150 mm, 5 m。6 流动相组成的确定 由于有机相的含量对目标化合物洗脱影响较大，采用等梯度洗脱时，若有机相含量低，伐他达那非难以洗脱，提高有机相含量，不仅伐地那非、西地那非分离不佳，而且育亨宾洗脱速度太快，易产生离子抑制效应，影响定量分析，因而我们采取了梯度洗脱方式。通过实验证明，在流动相中加入0.1%的乙酸，可以减少拖尾，优化色谱峰型。经过实验证明，流速为500 L/min， 在下列梯度洗脱条件（见表4）下，4种目标化合物均得到了很好的分离（见图4）。表4 流动相梯度洗脱程序时间min0.1%乙酸水溶液

16、%乙腈0.0080.020.03.008.005.095.013.0013.0120.00图 4 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非标准提取离子叠加色谱图及提取离子色谱图5、标准曲线和线性范围在所选择的LC/MS/MS 条件下，采用选择的定量离子，4种目标化合物在1ng/mL-100ng/mL范围内成线性关系，线性方程、相关系数和线性曲线见图5-8。图 5 育亨宾定量离子对（355.2/144.1）线性曲线（r=0.9997）图6 伐地那非定量离子对（486.5/151.1）线性曲线（r=0.9993）图 7 西地那非定量离子对（475.3/100.1）线性曲线r=0.9997图 8 他达那

17、非定量离子对（390.4/268.3）线性曲线r=0.9996超出线性范围后，应当对提取液进行适当的稀释，使得检测的响应在线性范围之内。根据样品处理方法,在此浓度范围内，它们分别相当于样品含有目标化合物：固体样品为1.0 mg/kg100.0 mg/kg的含量范围,液体样品为0.010 mg/L100.0 mg/L.此时固体样品的检测定量低限为1.0 mg/kg，液体样品的定量低限为 0.01 mg/L，满足保健食品中是否添加有这4种违禁药物检验要求。图 9 育亨宾检测低限1 ng/mL 提取离子色谱图图 10 伐地那非检测低限1 ng/mL 提取离子色谱图图 11 西地那非检测低限1 ng/

18、mL 提取离子色谱图图 12 他达那非检测低限1 ng/mL 提取离子色谱图6、实验室内精密度实验6.1 量取待测试样1.0 mL 于10.0 mL 容量瓶中，加入0.1 %乙酸l+甲醇（1+1，V/V）经充分混匀后定容，过0.45 m 微孔滤膜后，上LC/MS/MS 测定。实验试样：氨基酸饮品，该试样不含待测违禁物。表 5 氨基酸饮品育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非添加实验室内精密度实验结果添加水平（ng/mL） 伐地那非 西地那非 他达那非 测定结果（ng/mL）变异系数CV（%） 回收率（%）变异系数CV（%） 测定结果（ng/mL） 变异系数 CV（%） 10.0 10.4 5.8

19、93.6-1129.77 5.781.1-97.99.95 5.391.1-1075.5 82.1-97.79.80 8.91 9.11 8.58 11.2 9.15 9.42 9.27 9.369.09 10.79.03 10.7 8.119.78.8510.29.48 10.2 8.2150.0 51.9 2.4 96.6-10448.2 4.686.6-99.245.6 4.891.2-1033.9 89.8-10150.4 49.6 51.6 50.6 48.3 43.3 49.3 51.5 47.6 50.148.6 44.7 45.3 50.2 50.3 45.9 44.9 100

20、 97.5 4.4 94.4-10495.84.385.6-98.699.1 3.0 95.8-10596.5 4.2 92.8-103102.8 93.9 95.8 98.9 92.298.6 101.4 90.9 94.494.3105.3102.7104185.693.795.6 91.798.792.8图 13试剂空白提取离子叠加色谱图图 14 氨基酸口服液提取离子叠加色谱 图 15 氨基酸口服液添加10 g/L 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图图 16氨基酸口服液添加50 g/L 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图图 17 氨基酸口服液添加1

21、00 g/L 育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非提取离子叠加色谱图6.2、片剂样品提取方法的选择及实验室内回收率称取碾碎混匀的样品1.00 g于100 mL 容量瓶中，加入80 mL甲醇于超声波清洗器中超声处理30 min 后，取出冷却，用甲醇定容并充分混匀，定量取1.0 mL 提取液于10.0 mL 容量瓶中，用0.1%乙酸+甲醇（1+1）定容后混匀，过0.45m 微孔滤膜后，上LC/MS/MS 测定。我们选择了可邦男性抗衰老片作为添加回收实验样，经试验该试样中不含这4种违禁药物。表 6 可邦 男性抗衰老片中添加育亨宾、伐地那非、西地那非、他达那非实验室内精密度数据及回收率伐地拉非西地拉非测定结果mg/kg 变异系数CV 测定结果（mg/kg） 系数CV 样品 未检出未检出